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        基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪治療慢性腎臟病的分子機(jī)制*

        2022-10-12 09:05:10張寶霞陳小飛陳文佳丁海波饒克瑯章小穩(wěn)
        河南中醫(yī) 2022年11期
        關(guān)鍵詞:網(wǎng)絡(luò)圖腎臟病靶點(diǎn)

        張寶霞,陳小飛,陳文佳,丁海波,饒克瑯,章小穩(wěn)

        1.新余市中醫(yī)院,江西 新余 338000; 2.深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院,廣東 深圳 518133

        隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人們的生活水平日益提高,居民日常作息也發(fā)生改變,主要疾病由營養(yǎng)不良轉(zhuǎn)變?yōu)楦黝惵约膊?,且呈年輕化趨勢(shì)[1]。既往研究顯示,我國成年人慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)的發(fā)病率已超過10%,由此可推算,我國CKD患者已超1億[2]。CKD的臨床表現(xiàn)隱匿,許多患者沒有癥狀(無癥狀性血尿和/或蛋白尿)或僅有非特異性癥狀(腰部酸脹感),導(dǎo)致其診斷較為困難。晚期CKD除了發(fā)展為終末期腎功能衰竭需長(zhǎng)期透析治療外,還影響多個(gè)系統(tǒng)、器官的功能,包括但不限于眼底病變,凝血功能異常,代謝異常,消化、神經(jīng)及血液等系統(tǒng)并發(fā)癥,水、電解質(zhì)代謝紊亂及酸堿平衡失調(diào)[3]。CKD發(fā)展至終末期腎臟病后,其治療費(fèi)成倍增加且無完全治愈方法,是世界各國共有的公共衛(wèi)生問題[4]。

        黃芪為豆科植物膜莢黃芪或蒙古黃芪的根,被列為本草上品,有“補(bǔ)藥之長(zhǎng)”之稱,甘溫,入脾、肺經(jīng),具有“逐五臟間惡血”“通調(diào)血脈、流行經(jīng)絡(luò)”等功效[5]?,F(xiàn)代藥理研究也證明,黃芪具有改善心血管、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老等藥理作用[6]。劉新祥教授、遠(yuǎn)方教授、呂冬梅教授等都認(rèn)為,黃芪在腎臟病的治療中起著至關(guān)重要的作用,且遣方用藥中多以黃芪為主[7-9]。然而,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)黃芪治療慢性腎臟病仍然存在理解不清和認(rèn)識(shí)模糊的現(xiàn)象,為了有效地將“黃芪”和“慢性腎臟病”融合起來,本文基于系統(tǒng)藥理學(xué)研究,整合黃芪活性成分、潛在靶標(biāo)、相關(guān)疾病以及藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù),構(gòu)建系統(tǒng)水平上的藥物-成分-疾病靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò),從整體水平闡明中藥靶標(biāo)及其作用機(jī)理。

        1 資料與方法

        1.1 黃芪活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的篩選在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)[10]中檢索黃芪中的化合物,并按照藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)中的2個(gè)屬性值——口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%及類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18進(jìn)行活性成分初步篩選,獲得有效活性成分化合物及其相關(guān)作用靶點(diǎn)。將獲得的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)對(duì)其名稱進(jìn)行校正;若UniProt中未檢索到相關(guān)名稱,則在DrugBank Online數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)中檢索其別稱,再利用UniProt數(shù)據(jù)庫對(duì)其別稱進(jìn)行校正。校正結(jié)束后舍去重復(fù)靶點(diǎn)及無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)。

        1.2 CKD靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及黃芪治療CKD的潛在靶點(diǎn)搜集在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)檢索疾病關(guān)鍵詞“chronic kidney disease”,獲得CKD相關(guān)疾病靶點(diǎn),并在DrugBank Online數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充治療慢性腎臟病的西藥作用靶點(diǎn)。將黃芪活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與CKD相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/),取交集靶點(diǎn),即為黃芪治療CKD的潛在靶點(diǎn),并繪制韋恩圖。

        1.3 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將黃芪治療CKD的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String(https://cn.string-db.org/)在線數(shù)據(jù)庫繪制PPI網(wǎng)絡(luò),選擇“Multiple proteins”并設(shè)定最小互相作用閾值>0.9,其余設(shè)置均為默認(rèn)設(shè)置,隱藏游離節(jié)點(diǎn),運(yùn)行得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)果以TSV格式文件導(dǎo)出。將結(jié)果導(dǎo)入CytoScape 3.9.1軟件進(jìn)行拓?fù)浞治?,?jì)算度(degree)值,并以其中位數(shù)為界限篩選出黃芪治療CKD的核心靶點(diǎn)。

        1.4 核心靶點(diǎn)的基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號(hào)通路富集分析利用Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.html)[11]對(duì)黃芪治療CKD的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和京都基因與基因組百科全書信號(hào)通路富集分析,GO功能富集分析涉及生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)及分子功能(molecular function,MF)。

        1.5 “黃芪-活性成分-潛在靶點(diǎn)-信號(hào)通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖利用Excel構(gòu)建“黃芪-活性成分”“活性成分-潛在靶點(diǎn)”“疾病-潛在靶點(diǎn)”“潛在靶點(diǎn)-通路”文件,并將文件導(dǎo)入CytoScape 3.9.1軟件,構(gòu)建“黃芪-活性成分-潛在靶點(diǎn)-信號(hào)通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

        2 結(jié)果

        2.1 黃芪活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)基于TCMSP共搜集到黃芪有效成分20個(gè)及相關(guān)靶點(diǎn)204個(gè),對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)目排名前10位的有效成分為槲皮素(quercetin,148個(gè)靶點(diǎn))、山柰酚(kaempferol,62個(gè)靶點(diǎn))、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇(7-O-methylisomucronulatol,45個(gè)靶點(diǎn))、刺芒柄花素(formononetin,39個(gè)靶點(diǎn))、異鼠李素(isorhamnetin,37個(gè)靶點(diǎn))、華良姜素(jaranol,24個(gè)靶點(diǎn))、3,9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚(3,9-di-O-methylnissolin,23個(gè)靶點(diǎn))、毛蕊異黃酮(calycosin,23個(gè)靶點(diǎn))、白樺脂酸(mairin,13個(gè)靶點(diǎn))、(6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol(23個(gè)靶點(diǎn))等,以上所有成分均經(jīng)化源網(wǎng)(https://www.chemsrc.com/)檢索出中文名稱。利用UniProt數(shù)據(jù)庫檢索出204個(gè)靶標(biāo)對(duì)應(yīng)的200個(gè)官方基因名(其中3個(gè)蛋白質(zhì)在人類物種中缺乏,另一個(gè)蛋白在UniProt中未檢索出官方名,故舍去4個(gè)靶標(biāo))。見表1。

        表1 黃芪有效成分相關(guān)信息表

        2.2 CKD靶點(diǎn)及黃芪治療CKD的潛在靶點(diǎn)檢索數(shù)據(jù)庫得出CKD對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)13 955個(gè),設(shè)定score值>20%,則篩選出對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)1 266個(gè),將黃芪活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與CKD對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny2.1.0,得到黃芪治療CKD的潛在靶點(diǎn)104個(gè),涉及基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2,MMP2)、凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-X(BCL2-like 1,BCL2L1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(caspase 8,CASP8)、CASP9、組織蛋白酶D(cathepsin D,CTSD)、小窩蛋白1(caveolin 1,CAV1)、CD40 配體(CD40 ligand,CD40LG)、腫瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)、Ⅲ型膠原蛋白α1(collagen type Ⅲ alpha 1,COL3A1)、C 反應(yīng)性蛋白(C-reactive protein,CRP)等。見圖1。

        圖1 黃芪活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與CKD相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

        2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)將104個(gè)黃芪治療CKD的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String在線數(shù)據(jù)庫,獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖,并利用CytoScape3.9.1軟件進(jìn)行分析。該P(yáng)PI 網(wǎng)絡(luò)圖共有103個(gè)節(jié)點(diǎn)及2 067條邊,degree平均值為40.14,以degree值中位數(shù)為界限篩選出53個(gè)核心作用靶點(diǎn),其中degree值排名前10位的靶點(diǎn)分別為白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6,degree值88)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF,degree值87)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase 1,AKT1,degree值84)、IL-1β(degree值83)、TP53(degree值79)、MMP9(degree值77)、CASP3(degree值76)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase,PTGS2,degree值73)、JUN(degree值73)、IL-8(又稱CXCL8,degree值72),提示這些靶點(diǎn)可能是黃芪治療慢性腎臟病的核心靶點(diǎn)。見圖2。

        圖2 黃芪治療CKD潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

        2.4 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析KEGG信號(hào)通路富集分析獲得32條信號(hào)通路,主要涉及癌癥通路(pathways in cancer)、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化(lipids and atherosclerosis)、IL-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、前列腺癌(prostate cancer)、化學(xué)致癌-活性氧途徑(chemical carcinogenesis-reactive oxygen species)、化學(xué)致癌-受體激活途徑(chemical carcinogenesis-receptor activation)、瘧疾(malaria)、小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer)、低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)(transcriptional misregulation in cancer)等。根據(jù)校正后P值進(jìn)行排序,選擇前20條通路繪制柱狀圖。見圖3。GO功能富集分析得到104個(gè)生物過程(biological process,BP),104個(gè)細(xì)胞組分(cellular component,CC)及104個(gè)分子功能(molecular function,MF),其中BP主要涉及對(duì)無機(jī)物的反應(yīng)(response to inorganic substance)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of cell migration)、細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of cell death)、腺體發(fā)育(gland development)、細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)(regulation of cell adhesion)等;CC主要涉及膜筏(membrane raft)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物(transcription regulator complex)、囊泡腔(vesicle lumen)、絲氨酸型肽酶復(fù)合物(serine-type peptidase complex)、質(zhì)膜外側(cè)(external side of plasma membrane)、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物(plasma membrane protein complex)等;MF主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(DNA-binding transcription factor binding)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、激酶結(jié)合(kinase binding)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合(protein domain specific binding)、蛋白酶結(jié)合(protease binding)、蛋白質(zhì)同二聚化活性(protein homodimerization activity)、磷酸酶結(jié)合(phosphatase binding)、絲氨酸水解酶活性(serine hydrolase activity)、轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)子結(jié)合(transcriptional coregulator binding)等。將結(jié)果分別按照P值排序,選擇前20條結(jié)果繪制柱狀圖。見圖4、圖5、圖6。

        圖3 KEGG富集分析結(jié)果

        圖4 GO富集分析結(jié)果(生物過程)

        圖5 GO富集分析結(jié)果(細(xì)胞組分)

        2.5 “黃芪-活性成分-潛在靶點(diǎn)-信號(hào)通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖將黃芪、黃芪活性成分、疾病、潛在靶點(diǎn)、信號(hào)通路導(dǎo)入CytoScape3.9.1軟件,構(gòu)建“黃芪-活性成分-潛在靶點(diǎn)-信號(hào)通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。圖中黃色圓形代表黃芪,綠色三角代表黃芪活性成分,藍(lán)色四邊形代表潛在靶點(diǎn),紅色V型代表信號(hào)通路,紫色六邊形代表疾病。見圖7。

        圖6 GO富集分析結(jié)果(分子功能)

        圖7 “黃芪-活性成分-潛在靶點(diǎn)-信號(hào)通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

        3 討論

        既往文獻(xiàn)總結(jié)黃芪的化學(xué)成分包括多糖類、皂苷類、黃酮類及氨基酸、微量元素、甾醇類等物質(zhì),其中黃酮類主要有效活性成分多達(dá)30余種,主要有槲皮素、異鼠李素、毛蕊異黃酮等,具有發(fā)揮清除自由基、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抑制血管內(nèi)皮單層通透性增加等作用[12]。張薔等認(rèn)為黃芪通過黃酮類成分發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗損傷、抗突變、抗腫瘤、抑制動(dòng)脈粥樣硬化等活性[13]。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)到黃芪有效成分中對(duì)應(yīng)靶標(biāo)數(shù)目前10位的化合物分別為槲皮素(黃酮類)、山柰酚(黃酮醇類)、刺芒柄花素(異黃酮類)、異鼠李素(黃酮類)、華良姜素(黃酮醇類)、毛蕊異黃酮(黃酮類)、白樺脂酸(三萜類)等。綜上可知,黃芪治療慢性腎臟病的主要有效活性成分可能為黃酮類。

        通過PPI網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn),IL-6、TNF、AKT1、IL-1β、TP53、MMP9、CASP3、PTGS2、JUN、CXCL8可能是黃芪治療慢性腎臟病的核心靶點(diǎn)。IL-6是在免疫、組織再生和新陳代謝中具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子,與IL-6受體結(jié)合后,進(jìn)一步與信號(hào)亞基IL-6信號(hào)傳導(dǎo)因子/糖蛋白130(IL-6 signal transducer/glycoprotein 130,IL-6ST/gp130)結(jié)合以觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)IL-6信號(hào)通路。與膜結(jié)合的重組人IL-6受體(recombinant human IL-6 receptor,IL-6R)和 IL-6ST的相互作用刺激“經(jīng)典信號(hào)”,通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothlial growth factor,VEGF)直接或間接導(dǎo)致血管生成活性增加;另外,IL-6可充當(dāng)肌因子,在組織損傷期間起保護(hù)作用,是維持組織再生所必需的;也可通過激活I(lǐng)L-6ST-YAP-NOTCH通路誘導(dǎo)上皮細(xì)胞再生[14]。TNF主要由巨噬細(xì)胞分泌,可誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞死亡,還是通過直接作用或刺激IL-1分泌而引起發(fā)熱的強(qiáng)熱原,并與惡病質(zhì)的誘導(dǎo)有關(guān),在某些條件下可刺激細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞分化[15]。AKT1是胞內(nèi)磷脂酰肌醇3激酶(phosphoInositide-3 kinase,PI3K)下游的直接靶蛋白,可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和代謝,促進(jìn)纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成[16]。此外AKT1激活可促進(jìn)核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)激活,啟動(dòng)下游炎癥反應(yīng),產(chǎn)生TNF-α、IL-6等炎性因子,加重細(xì)胞的纖維化[17]。進(jìn)一步的研究表明,AKT是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子e-1(transforming growth factor e-1,TGFe-1)介導(dǎo)的生物過程的重要調(diào)節(jié)因子,可刺激Smad、mTOR等腎臟細(xì)胞調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),調(diào)節(jié)足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞功能[18]。關(guān)鍵靶基因中IL-6、IL-1β均是經(jīng)典的炎癥因子,PTGS2調(diào)控炎癥應(yīng)答,是炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì),通過引導(dǎo)中性粒細(xì)胞到達(dá)感染部位起到趨化因子的作用,兩者在炎癥反應(yīng)中具有特殊作用[19]。CXCL8與CXC趨化因子受體結(jié)合可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)并誘發(fā)組織炎癥[20],研究證實(shí),阻斷CXC趨化因子受體傳導(dǎo)可以減輕小鼠的腎臟炎癥和腎纖維化[21]。TNF、TP53與腫瘤密切相關(guān),MMP9、CASP3參與細(xì)胞凋亡。而慢性腎臟病的發(fā)病及進(jìn)展均與腎臟纖維化有關(guān)[22],近年來,圍繞腎纖維化發(fā)生的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)其與炎癥、巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和促纖維化通路等的異?;罨嘘P(guān)[23],且慢性腎臟病終末期死亡原因中惡性腫瘤的死亡原因超過10%,排所有死亡原因的第3位[24],與本次研究所涉及的靶點(diǎn)不謀而合。有研究同樣也發(fā)現(xiàn),黃芪可以從多個(gè)層面調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng),直接影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡,調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期生長(zhǎng),也可以通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)間接改變腫瘤微環(huán)境,抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移[25]。

        GO生物過程分析可得,黃芪有效成分可通過作用于細(xì)胞的膜筏、細(xì)胞外基質(zhì)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、囊泡腔、質(zhì)膜外側(cè)、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、髓鞘、軸突等部位,參與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、磷酸酶結(jié)合等分子功能的調(diào)節(jié),調(diào)控癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、無機(jī)物及脂多糖的反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路、細(xì)胞遷徙及死亡的正向調(diào)節(jié)、上皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)等治療慢性腎臟病。

        本文預(yù)測(cè)了黃芪治療慢性腎臟病的主要靶點(diǎn),并對(duì)主要靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG及GO分析,結(jié)果表明,黃芪可能通過抗感染、抑制纖維化、調(diào)控細(xì)胞凋亡等信號(hào)通路治療慢性腎臟病。

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