矯 巖，李 丹，劉文東，韓文超

(青島市市立醫(yī)院兒科，山東 青島 266000)

肺炎是全世界兒童死亡的第二大原因。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)提出出現(xiàn)臨床體征和癥狀(包括咳嗽、發(fā)燒、進(jìn)食不良、發(fā)紺、呼嚕聲、鼻腔擴(kuò)張、呼吸急促及下胸壁內(nèi)陷)合并放射學(xué)結(jié)果進(jìn)行肺炎診斷[1]，但病例個(gè)體差異及檢測(cè)手段不同往往會(huì)影響肺炎的診斷，而且約9%肺炎兒童易出現(xiàn)復(fù)發(fā)。因此，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并積極治療對(duì)提高患者生活質(zhì)量意義重大。靶向篩查及治療近年來(lái)應(yīng)用廣泛，微小RNA(microRNA，miRNA)是小非編碼單鏈RNA，約22～24個(gè)核苷酸組成，在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，miRNA表達(dá)失調(diào)影響細(xì)胞活動(dòng)和疾病進(jìn)展[2]。Huang等[3]提出，在肺炎發(fā)病機(jī)制中存在miRNA表達(dá)失調(diào)。炎癥因子可激活疾病過(guò)程中炎癥反應(yīng)，一定程度反映肺炎嚴(yán)重程度及免疫反應(yīng)進(jìn)程[4]，因此，本項(xiàng)目主要研究血清中miR-147a和miR-217表達(dá)變化與炎癥指標(biāo)及肺功能指標(biāo)的相關(guān)性，旨在尋找兒童肺炎無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)志物，改善肺炎診斷及治療效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月至2021年12月于青島市市立醫(yī)院接受治療的100例肺炎患兒為研究對(duì)象(肺炎組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①本研究要求肺炎病原體為肺炎支原體，符合《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識(shí)(2015年版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)；②無(wú)其他肺部相關(guān)炎癥疾病；③無(wú)哮喘、心肌相關(guān)炎癥等疾病；④未接受過(guò)其他衛(wèi)生單位治療及無(wú)自行用藥；⑤患者家屬溝通順暢，并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他呼吸道感染疾??；②存在免疫缺陷問(wèn)題；③臨床資料不全。肺炎組年齡1～9歲，平均年齡(5.33±1.37)歲，男54例，女46例。并選取同一時(shí)期來(lái)院做健康體檢的41例兒童作為對(duì)照組，年齡1～10歲，平均年齡(6.21±1.29)歲，男21例，女20例。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

1.2 研究方法

1.2.1靜脈血檢測(cè)

所有研究對(duì)象均抽取空腹靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心10 min后將血清取出置于-80℃保存待用。利用RNA提取試劑盒(Invitrogen，貨號(hào)為10296010)提取總RNA，再按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，貨號(hào)為4368813)操作說(shuō)明制備cDNA，以U6為內(nèi)參，RT-PCR分析miR-147a和miR-217相對(duì)表達(dá)水平，引物序列：miR-147a正向引物為ATTGGCAAGATGTTCCTTGC，反向引物為GTGTGTGGAAATGCTTCTGC；miR-217正向引物為GCCGTACTGCATCAGGAAC，反向引物為GCAGGGTCCGAGGTATTC；U6正向引物為T(mén)GCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC，反向引物為GTGCAGGGTCCGAGGT。通過(guò)2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)水平的量化分析。

1.2.2肺功能檢測(cè)

采用COSMEDPFT4型肺功能儀檢測(cè)肺功能指標(biāo)，主要包括呼氣流量(peak expiratory flow，PEF)，第一秒用力呼氣容積(force expiratory volume in the first second，F(xiàn)EV1)，用力肺活量(force vital capacity，F(xiàn)VC)及FEV1/FVC，25%、50%、75%肺活量的呼氣流速V25、V50、V75。

1.2.3炎癥因子檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-1β和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)含量，具體操作按照ELISA試劑盒要求進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清miR-147a和miR-217表達(dá)水平比較

肺炎組血清miR-147a、miR-217表達(dá)量均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為4.302、5.322，P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組兒童血清miR-147a和miR-217表達(dá)水平比較

2.2 兩組兒童肺功能比較

肺炎組兒童PEF、FEV1、FEV1/FVC、V25、V50、V75水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為5.921、6.035、8.392、5.772、7.274、9.926，P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組兒童肺功能比較

2.3 兩組兒童血清炎癥因子水平比較

肺炎組IL-6、IL-1β、TNF-α水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為28.372、9.372、11.285，P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組兒童血清炎癥因子表達(dá)水平比較

2.4 肺炎組兒童血清miR-147a、miR-217表達(dá)水平與肺功能和炎癥因子相關(guān)性分析

miR-147a、miR-217與肺功能指標(biāo)(PEF、FEV1、FEV1/FVC、V25、V50、V75)呈正相關(guān)(r值介于0.654～0.772之間，P<0.05)，與炎癥因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)呈負(fù)相關(guān)(r值介于-0.811～-0.784之間，P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。

表4 肺炎組兒童血清miR-147a、miR-217表達(dá)水平與肺功能和炎癥因子相關(guān)性分析

3 討論

肺炎是急性下呼吸道感染最嚴(yán)重的表現(xiàn)之一，是5歲以下兒童死亡的主要原因[5]。當(dāng)病原微生物侵入宿主時(shí)，可刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生炎癥因子，并在局部積聚，進(jìn)而引起呼吸道感染，臨床表現(xiàn)為支氣管炎、肺炎等[6]。感染早期出現(xiàn)明顯發(fā)燒、咳嗽、有痰、呼吸困難等癥狀，同時(shí)身體釋放炎癥因子、有毒代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，進(jìn)一步引發(fā)免疫功能紊亂[7]。兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未完善，因此肺炎感染血清中miRNA表達(dá)與肺功能及炎癥因子釋放的相關(guān)性尚不清楚，需要深入探討。

3.1 肺炎患兒miR-147a和miR-127表達(dá)下調(diào)

miRNA是由基因組非編碼區(qū)產(chǎn)生的內(nèi)源性單鏈小分子RNA，研究發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)異常與多種疾病發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。Chu等[8]研究提出，對(duì)比肺炎和正常兒童外周血miRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，存在26個(gè)顯著上調(diào)miRNAs和7個(gè)顯著下調(diào)miRNA。miRNA參與肺炎病理過(guò)程，并參與肺炎免疫應(yīng)答過(guò)程。Liu等[9]在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)小鼠肺炎的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，miR-147a表達(dá)顯著下調(diào)，并靶向作用于核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)激活蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥和損傷，miR-147a表達(dá)下調(diào)與小鼠IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α升高有關(guān)。miR-147a低表達(dá)參與汞誘導(dǎo)的人系膜細(xì)胞增殖、纖維化和氧化應(yīng)激，促進(jìn)糖尿病腎病惡性進(jìn)展[10]。另外，諸多學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-147a在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲中發(fā)揮抑制作用，過(guò)表達(dá)miR-147a可抑制NSCLC進(jìn)展[11-12]。Chen等[13]提出miR-217可作為新的診斷肺炎的生物標(biāo)志物，在LPS誘導(dǎo)小鼠重癥肺炎模型中，發(fā)現(xiàn)LPS處理可降低miR-127表達(dá)水平，過(guò)表達(dá)miR-127后可降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，并通過(guò)靶向抑制AKT和NF-KB信號(hào)通路，進(jìn)一步減輕重癥肺炎。Xie等[14]報(bào)道m(xù)iR-127可能通過(guò)靶向作用于免疫球蛋白受體減輕肺部炎癥，此外在支氣管肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)miR-127表達(dá)下調(diào)，這種異常表達(dá)可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物[15]。綜上，本研究將miR-147a和miR-127作為肺炎新興生物標(biāo)志物探討其與肺炎兒童肺功能和炎癥因子表達(dá)相關(guān)性，分析miR-147a和miR-127在兒童肺炎的臨床價(jià)值。

3.2 肺炎患兒miR-147a、miR-127表達(dá)與肺功能指標(biāo)呈正相關(guān)，與炎癥因子水平呈負(fù)相關(guān)

本研究結(jié)果表明，肺炎組兒童血清中miR-147a和miR-127表達(dá)顯著低于對(duì)照組，相關(guān)性分析結(jié)果表明，miR-147a和miR-127與肺功能指標(biāo)呈正相關(guān)，與細(xì)胞炎癥指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果提示miR-147a、miR-127與肺炎進(jìn)展密切相關(guān)，可能一方面為miR-147a、miR-127與抗炎因子靶基因結(jié)合，另一方面肺炎進(jìn)展誘導(dǎo)miR-147a和miR-127表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)釋放炎癥因子。Khadzhieva等[16]分析肺炎和肺功能之間的共享基因位點(diǎn)，經(jīng)基因富集分析發(fā)現(xiàn)，肺炎和肺功能基因集與炎癥相關(guān)特征基因之間存在顯著重疊。肺炎與細(xì)胞炎癥有關(guān)，TNF-α是單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種主要細(xì)胞因子，是一種重要的炎癥介質(zhì)[17]。TNF-α通過(guò)誘導(dǎo)局部浸潤(rùn)、中性粒細(xì)胞趨化、吞噬和殺死病原體來(lái)啟動(dòng)炎癥反應(yīng)[18]。IL-6和IL-1β是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要細(xì)胞因子，是炎癥反應(yīng)急性期的關(guān)鍵介質(zhì)[19]。本研究提示肺炎兒童患者miR-147a和miR-127表達(dá)下調(diào)與炎癥水平上升有關(guān)，與上述研究結(jié)果一致。這充分說(shuō)明血清miR-147a和miR-127表達(dá)水平介導(dǎo)肺炎發(fā)生、發(fā)展的主要基質(zhì)可能與調(diào)節(jié)肺功能基因及炎癥因子密切相關(guān)。本研究不足之處在于臨床樣本收集有限，miR-147a和miR-127參與肺炎進(jìn)展具體分子機(jī)制還需深入探討，后期研究將擴(kuò)大樣本并結(jié)合基礎(chǔ)研究開(kāi)展，為兒童肺炎診療提供可靠生物靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)兒童肺炎血清中miR-147a和miR-127表達(dá)下調(diào)，且與肺功能指標(biāo)呈正相關(guān)，與炎癥因子呈負(fù)相關(guān)，初步探明miR-147a和miR-127可能是潛在的肺炎診療靶點(diǎn)。