相亦飛，紀 敏，吳莉芩，何家康

(廣西大學 動物科學技術學院，南寧 530005)

隨著我國飼料禁抗令的頒布實施，獸醫(yī)臨床在藥物使用方面不斷規(guī)范和標準化，但用量過大過久或不合理的聯(lián)合用藥等情況依然普遍，導致動物機體出現(xiàn)嚴重的急性肝腎損傷(acute liver and kidney injury)，不斷危害著畜牧業(yè)的健康發(fā)展和食品安全，因此開發(fā)緩解肝腎損傷的藥物意義重大。在篩選緩解肝腎損傷藥物過程中，建立合理的肝腎損傷病理模型對于成功篩選藥物尤其關鍵。通過查閱大量文獻發(fā)現(xiàn)，順鉑(Cisplatin，CP)是臨床上使用最廣泛的化療藥物且藥效與其給藥劑量呈正比[1]，但用藥后會有嚴重的不良反應，尤其是肝、腎、耳、神經(jīng)毒性等是其臨床應用的最大限制[2]。目前由CP誘導的急性肝腎損傷病理模型的實驗動物種類和造模劑量并未規(guī)范和標準化。本試驗旨在以不同濃度的CP誘導建立Balb/c小鼠急性肝腎損傷模型，探究不同濃度CP對肝臟和腎臟的影響，尋找符合動物福利要求的最適建模濃度，為研制緩解或預防急性肝腎損傷的新獸藥提供簡單、穩(wěn)定、高效、可復制的病理模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Balb/c小鼠40只，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(合格證：SCXK(湘)2016-0002)，雄性，體重20 g±2 g。模擬正常環(huán)境適應性飼喂1周后進行試驗。

1.1.2 主要試劑 順鉑(CP)、二甲基亞砜(DMSO)，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，CRE)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

CP溶液配制：稱取20 mg CP粉溶解于10 mL/L DMSO，用9 g/L NaCl配成終濃度為4 mg/mL，并將其倍比稀釋為1 mg/mL 、2 mg/mL，配置好的溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.3 主要儀器 多功能酶標儀(Multimode PlateReader型)，瑞士TECAN公司產(chǎn)品；電子分析天平(AB104-L型)，瑞士梅特勒-托利多集團公司產(chǎn)品；臺式高速冷凍離心機(TGL20MC型)，西安禾普生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性肝腎損傷病理模型的建立 將40只Balb/c小鼠隨機分為健康對照組、CP(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)模型組4組，每組10只。禁食12 h后分組進行給藥，按照每只小鼠0.2 mL的劑量腹腔注射(intraperitoned injection，i.p.)10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg的CP誘導小鼠急性肝腎損傷，對照組則給予同樣劑量的9 g/L NaCl。

1.2.2 小鼠體重變化與臟器系數(shù) 每天按時對小鼠體重、精神狀況、皮毛光亮程度、飲水攝食以及排泄等情況進行記錄。乙醚麻醉小鼠后，完整摘取肝、腎、脾臟，用9 g/L NaCl浸洗2次后濾紙干燥，稱重、記錄并計算，計算公式如下(單位：g)：

體重變化=最終體重-初始體重

脾系數(shù)=小鼠脾重量/體重×100%

肝系數(shù)=小鼠肝重量/體重×100%

腎系數(shù)=小鼠腎重量/體重×100%

1.2.3 小鼠肝腎功能的檢測 72 h后，乙醚麻醉小鼠，眼球采血并收集于EP管中。4℃靜置過夜，3 000 r/min離心10 min后小心收集上層血清，用于血清ALT、AST、BUN、CRE的檢測。

1.2.4 組織病理學觀察 40 g/L中性甲醛溶液固定摘取的肝腎組織48 h，按照流程制作病理切片后，在顯微鏡下觀察其組間變化。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 SPSS Statistics 23進行單因素方差分析法分析數(shù)據(jù)，采用Mean±SD表示。P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。與對照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)；與CP(10 mg/kg)模型組相比，#表示差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)；與CP(20 mg/kg)模型組相比，Δ表示差異顯著(P<0.05)，ΔΔ表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果

2.1 CP誘導的急性肝腎損傷小鼠的臨床癥狀

試驗開始前，各組小鼠均狀態(tài)良好。腹腔注射10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg的CP后，逐漸出現(xiàn)采食飲水減少、精神不佳、被毛粗亂甚至脫毛的情況，部分小鼠出現(xiàn)蜷縮埋頭、食欲廢絕、排尿較少甚至無尿，肛門周圍污穢等現(xiàn)象。72 h后相比對照組，模型低劑量組(10 mg/kg)小鼠癥狀輕微，模型高劑量組(40 mg/kg)小鼠狀態(tài)極差、瀕臨死亡，模型中劑量組(20 mg/kg)小鼠癥狀明顯且不會影響生命。

2.2 CP對小鼠體重變化和臟器系數(shù)的影響

如表1所示，對照組小鼠體重隨時間推移逐漸增加，而各模型組小鼠隨計量增加體重顯著下降(P<0.01)，各組肝臟系數(shù)并無明顯差異。與對照組相比，各模型組隨給藥劑量的增加而腎系數(shù)顯著增加(P<0.05)，以40 mg/kg組最為顯著(P<0.01)。而脾系數(shù)相比對照組各濃度模型組小鼠的均極顯著降低(P<0.01)。結(jié)果表明CP具有劑量依賴毒性，劑量越高對小鼠的損害越嚴重。

表1 小鼠體重和臟器系數(shù)的變化Table 1 Changes in body weight and organ coefficients of mice

2.3 CP對小鼠肝功能的影響

如表2所示，與對照組相比，模型中高劑量組(20 mg/kg、40 mg/kg)小鼠的血清ALT含量均極顯著性升高(P<0.01)，各CP模型組小鼠的血清AST含量均極顯著性升高(P<0.01)。結(jié)果表明，CP可劑量依賴性地升高小鼠血清中ALT和AST含量，對肝功能產(chǎn)生較大的影響。

表2 小鼠肝功能的檢測Table 2 Detection of liver function in mice

2.4 CP對小鼠腎功能的影響

如表3，與對照組和模型低劑量組(10 mg/kg)相比，模型中、高劑量組(20 mg/kg、40 mg/kg)小鼠的血清BUN、CRE含量均極顯著升高(P<0.01)。結(jié)果表明CP可劑量依賴性地升高小鼠血清BUN、CRE含量。

表3 小鼠腎功能的檢測Table 3 Detection of kidney function in mice

2.5 CP誘導的小鼠急性肝腎損傷組織病理學觀察

2.5.1 小鼠肝組織病理學觀察 如圖1所示(HE,×400)，對照組小鼠的肝組織未觀察到組織病理學改變。相比對照組，模型低劑量組(10 mg/kg)小鼠的肝組織未發(fā)現(xiàn)明顯異常，模型中高劑量組(20 mg/kg、40 mg/kg)小鼠的肝組織明顯可見肝細胞空泡變性。

A.對照組；B.CP模型10 mg/kg組；C.CP模型20 mg/kg組；D.CP模型40 mg/kg組A.Control group；B.CP model 10 mg/kg group;C.CP model 20 mg/kg group;D.CP model 40 mg/kg group圖1 肝臟病理切片(HE,×400)Fig.1 Liver pathological sections (HE,×400)

3.5.2 小鼠腎組織病理學觀察 如圖2所示(HE,×400)，對照組小鼠的腎組織未觀察到組織病理學改變。與對照組相比，各劑量CP模型組小鼠的腎組織結(jié)構排列紊亂，模型低劑量組(10 mg/kg)小鼠的腎組織病理學改變較輕；模型高劑量組(40 mg/kg)小鼠的腎組織病理學改變最嚴重，腎組織近端小管表現(xiàn)出不同程度的退行性改變，如刷狀緣消失、胞質(zhì)空泡，腎上皮細胞脫落壞死等；模型中劑量組(20 mg/kg)小鼠的腎組織病理學改變顯著，且不會快速致死。

A.空白組；B.CP模型10 mg/kg組；C.CP模型20 mg/kg組；D.CP模型40 mg/kg組A.Control group；B.CP model 10 mg/kg group;C.CP model 20 mg/kg group;D.CP model 40 mg/kg group圖2 腎臟病理切片(HE,×400)Fig.2 Kidney pathological sections (HE,×400)

3 討論

通過嚙齒類動物構建病理模型是目前醫(yī)學研究的熱門首選之一，但對于急性肝腎損傷病理模型的試驗動物種屬和給藥劑量尚未有明確的報道。大量研究表明CP誘導的小鼠急性肝腎損傷的給藥劑量在5 mg/kg～40 mg/kg之間，劑量過小模型動物發(fā)病癥狀不明顯，劑量過大容易致死，沒有很好的遵循動物福利原則[3，4]。通過查閱大量文獻最終選用Balb/c小鼠為建模動物，一次性單劑量腹腔注射10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg的CP構建小鼠急性肝腎損傷病理模型，于72 h時采樣觀察以評價模型的成功與否。

試驗發(fā)現(xiàn)，模擬臨床使用CP治療疾病時，模型小鼠的臨床癥狀在劑量和時間上是具有依賴性的[5,6]。低劑量治療時，小鼠出現(xiàn)貧血、體重減輕、活動量減少、采食飲水量減少等情況[7]；提高劑量治療時，小鼠表現(xiàn)為典型的被毛凌亂、活動量減少、脫水、無食欲，隨著時間的推移小鼠血清ALT、AST、BUN、CRE等肝腎生化指標明顯升高，并出現(xiàn)脫毛、弓背、嗜睡、消瘦、出血性腹瀉、體溫降低。在4 d左右小鼠死亡，剖檢可見胸腺萎縮，小腸內(nèi)有出血現(xiàn)象[8]，通過組織病理學觀察結(jié)果顯示，肝腎組織出現(xiàn)較為明顯的損傷[9]。CP給藥可劑量依賴性地降低脾系數(shù)，增加腎系數(shù)，并升高小鼠血清BUN、CRE、ALT、AST含量[10-15]，小鼠在給藥40 mg/kg的CP后，表現(xiàn)出嚴重的臨床癥狀且瀕臨死亡。該試驗結(jié)果表明，給藥小鼠40 mg/kg時，可能發(fā)展成全身毒性，遭受嚴重痛苦，不適合后續(xù)的試驗研究。

綜上所述，CP誘導的小鼠急性肝腎損傷模型具有簡單、可復制性、易于誘導、價格低廉等特點，且具有很高的臨床相關性，一次性單劑量腹腔注射即可導致肝腎損傷。本試驗選用Balb/c小鼠一次性單次腹腔注射不同劑量(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)的CP均可造成小鼠肝腎功能損傷，給予CP 10 mg/kg處理的小鼠肝腎損傷程度較輕，而經(jīng)CP 40 mg/kg處理的小鼠肝腎組織嚴重損傷，小鼠瀕臨死亡。

綜合小鼠臨床癥狀及表現(xiàn)、血清肝腎功能指標水平以及肝腎組織病理學變化結(jié)果，遵循動物福利原則[16，17]，避免使用引起全身急性毒性的給藥方案，本試驗確定小鼠急性肝腎損傷模型方式為單次腹腔注射20 mg/kg的順鉑(CP)。