王海論，黃曉宇，余春辰，殷光文，王登峰，王 磊，黃志堅

(福建農林大學 動物科學學院(蜂學學院)/福建省動物藥物工程實驗室，福建福州 350002)

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種能感染幾乎所有溫血動物的細胞內寄生原蟲，主要侵入腦部、眼、胎盤和睪丸等組織器官[1-2]。多數情況呈隱性感染，在免疫力低下時，可引發(fā)多種疾病，母畜懷孕后可能發(fā)生流產、產死胎和畸形胎，并將弓形蟲傳給下一代[3]。雄性動物感染可發(fā)生性功能下降、生殖系統(tǒng)損傷、精子數量減少或畸形等嚴重后果[4]。睪酮是由睪丸間質細胞分泌產生的，在精子成熟、刺激生殖器生長和維持性功能等方面具有重要作用[5]。多數研究表明，弓形蟲急性感染能造成動物血清中睪酮含量的改變，但關于弓形蟲感染影響睪酮分泌機制的研究較少。

睪丸間質細胞是產生和分泌睪酮的主要細胞[6]，以睪丸間質細胞為對象開展弓形蟲影響雄性生殖障礙的相關研究具有重要意義。下丘腦-垂體-性腺軸是調控睪酮合成的經典途徑，垂體釋放的黃體生成素(luteinizing hormone,LH)與睪丸間質細胞上的LH受體結合后啟動睪酮的合成，體外試驗中通常使用人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)來代替LH來刺激睪丸間質細胞分泌睪酮[7]。膽固醇在LH的作用下迅速被動員，在類固醇激素合成相關酶的作用下生成睪酮，其中類固醇合成急性調節(jié)蛋白(StAR)、3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD)、P450側鏈裂解酶(CYP11A1)和P450側鏈切割酶 17α(CYP17A1)是此過程中影響睪酮分泌的關鍵酶[8-9]，睪酮合成過程中這些酶含量的改變會影響睪酮的生成。

本研究以小鼠睪丸間質細胞瘤細胞(murine Leydig tumor cell line-1，MLTC-1)為細胞系，構建體外弓形蟲共培養(yǎng)體系，探索弓形蟲體外感染對小鼠睪丸間質細胞分泌睪酮的影響，為進一步探究弓形蟲對雄性動物睪酮分泌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲株與細胞 弓形蟲速殖子(RH株)由中國農業(yè)大學索勛教授惠贈，小鼠睪丸間質細胞瘤細胞MLTC-1細胞由本實驗室液氮保存。

1.1.2 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶，美國Gibco公司產品；胎牛血清，美國 ZETA Life公司產品；瑞氏-吉姆薩染色液，武漢賽維爾生物科技有限公司產品；Percoll，北京索萊寶科技有限公司產品；睪酮檢測試劑盒，中國北京北方生物技術有限公司產品；全蛋白提取試劑盒，江蘇凱基生物技術股份有限公司產品；Anti-StAR antibody、Anti-CYP11A1 antibody、Anti-Cytochrome P450 17A1 antibody和Anti-Beta Actin antibody，杭州華安生物技術有限公司產品；HSD3B2 Antibody ，Affinity Biosciences公司產品；BCA 蛋白測定試劑盒、HRP標記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG，均為北京全式金生物技術有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 Infinite M200 Pro多功能酶標儀，帝肯(上海)貿易有限公司產品；DYY-10C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司產品；LS-CO150 CO2培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技公司產品；尼康Ti數碼倒置熒光顯微鏡，上海恒浩儀器公司產品；HFsafe-1200LC生物安全柜，上海力申科學儀器有限公司產品；Azure Imager多功能分子成像系統(tǒng)，深圳恩科生物科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 RH株速殖子純化 37℃、5% CO2環(huán)境下，使用含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)MLTC-1細胞，24 h后將復蘇的弓形蟲RH株速殖子加入到MLTC-1細胞中培養(yǎng)，經96 h后90%以上的細胞破裂，用1 mL注射器反復吹打使細胞充分破裂，將細胞碎屑與弓形蟲離心后，用40% Percoll分離液重懸，3 000 r/min離心10 min，收集沉淀，PBS清洗兩次后獲得純化的弓形蟲速殖子。

1.2.2 弓形蟲處理MLTC-1細胞濃度與時間的篩選 于24孔板中按5×104個/孔的數量加入MLTC-1細胞，培養(yǎng)24 h，細胞換液后，加入含1 IU/mL hCG和弓形蟲的培養(yǎng)液，弓形蟲與細胞比例為0∶1(對照組)、1∶5、1∶1、5∶1、10∶1和20∶1，共6組，每組3個復孔，培養(yǎng)6 h，收集細胞上清。同樣，加入含1 IU/mL hCG和弓形蟲的培養(yǎng)液，以弓形蟲與細胞比例為20∶1分別與MLTC-1細胞共培養(yǎng)3 h、6 h、9 h和12 h，共4組，每組內設對照組與感染組，收集細胞及上清。

1.2.3 顯微鏡觀察 以蟲體與細胞比例為20∶1分別與MLTC-1細胞共培養(yǎng)0 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h、60 h和72 h，瑞氏-吉姆薩染色，顯微鏡觀察共培養(yǎng)情況。

1.2.4 ELISA檢測細胞上清睪酮濃度 收集細胞上清，將其稀釋50倍后，按睪酮檢測試劑盒說明書操作，檢測收集的細胞上清液中的睪酮濃度。

1.2.5 Western blot檢測睪酮分泌相關蛋白的表達 按照全蛋白提取試劑盒說明提取細胞全蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白含量。蛋白變性后按20 μg/孔上樣，進行SDS-PAGE 電泳，利用半干式轉膜儀將蛋白轉移到PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗(StAR抗體，1∶1 000稀釋；3β-HSD抗體，1∶1000稀釋；CYP11A1抗體，1∶1 000稀釋；CYP17A1抗體，1∶500稀釋；β-actin抗體，1∶1 000稀釋)孵育過夜，TBST洗滌4次，5 min/次，二抗(HRP標記山羊抗鼠IgG，1∶3000稀釋；HRP標記山羊抗兔IgG，1∶3 000稀釋)室溫孵育1h，同樣用TBST洗滌后，ECL發(fā)光液顯色，拍照分析結果。

1.2.6 統(tǒng)計分析 使用SPSS 25.0軟件對試驗數據進行統(tǒng)計學分析，n≥3，P<0.05 表示差異顯著。利用GraphPad Prism 8軟件繪圖。

2 結果

2.1 弓形蟲感染MLTC-1細胞濃度的篩選

弓形蟲和MLTC-1細胞在不同比例下共培養(yǎng)6h后，收集的細胞上清使用ELISA檢測其睪酮濃度。結果如圖1所示，隨弓形蟲與細胞比例的增加，睪酮分泌量也逐漸增加，低感染比例下睪酮分泌量變化不明顯。弓形蟲與細胞比例高于5∶1時，弓形蟲感染的組睪酮分泌量顯著高于未感染組，即0∶1組(P<0.05)。

a～c.不同字母表示各組間差異顯著，P<0.05。a-c.Different letters represent significant difference,P<0.05.圖1 弓形蟲與MLTC-1細胞在不同比例下共培養(yǎng)6 h的睪酮分泌水平Fig.1 Testosterone secretion levels of Toxoplasma gondii and MLTC-1cells cocultured with different ratios for 6 h

2.2 弓形蟲感染MLTC-1細胞時間的篩選

ELISA檢測弓形蟲與細胞比例為20∶1共培養(yǎng)3 h、6 h、9 h和12 h的上清睪酮濃度，結果如圖2所示，睪丸間質細胞睪酮的分泌量隨弓形蟲處理處理時間的延長而增加，并且感染組在各時間段的睪酮分泌量顯著高于對照組(P<0.05)。

a～c.不同字母表示各組間差異顯著，P<0.05。a-c.Different letters represent significant difference,P<0.05.圖2 不同時間段下弓形蟲感染MLTC-1細胞的睪酮分泌水平 Fig.2 Testosterone secretion levels in MLTC-1 cells infected with Toxoplasma gondii for different time periods

2.3 弓形蟲感染后MLTC-1細胞狀態(tài)的觀察

通過瑞氏-吉姆薩染色后，觀察弓形蟲與細胞比例為20∶1情況下弓形蟲入侵MLTC-1細胞過程，如圖3所示，共培養(yǎng)0.5 h，弓形蟲開始接近MLTC-1細胞；1 h時大量弓形蟲接近MLTC-1細胞；3 h時大部分弓形蟲進入細胞；12 h時細胞中出現大量空泡，隨弓形蟲入侵時間延長，空泡逐漸增加，60 h時細胞大量破裂。

弓形蟲與細胞比例為20∶1。0 h～3 h.弓形蟲逐漸接近MLTC-1細胞；3 h～12 h.弓形蟲進入細胞；12 h～48 h.空泡逐漸增加；48 h～72 h.細胞逐漸破裂。箭頭所示：3 h.游離的速殖子；12 h.細胞內速殖子；24 h.胞內空泡；72 h.破裂的細胞。The Toxoplasma gondii to cell ratio was 20∶1.0 h-3 h.Toxoplasma gondii gradually approached MLTC-1 cells;3 h-12 h.Toxoplasma gondii into the cells;12 h-48 h.vacuoles increased gradually;48 h-72 h.the cells broken gradually.Arrow:3 h.Free tachyzoite;12 h.Intracellular tachyzoites;24 h.Vacuole;72 h.Ruptured cells圖3 弓形蟲在MLTC-1細胞中的入侵和增殖過程(瑞氏-吉姆薩染色，×400)Fig.3 Invasion and proliferation processes of Toxoplasma gondii in MLTC-1cells (Swiss Giemsa staining,× 400)

2.4 弓形蟲感染對MLTC-1細胞睪酮分泌相關酶的影響

Western blot結果顯示，弓形蟲與細胞比例為20∶1，感染組與對照組的StAR蛋白表達變化不明顯，共培養(yǎng)9 h時，感染組的CYP11A1和3β-HSD的蛋白相對表達水平顯著下降，且12 h時CYP17A1的蛋白相對表達水平也顯著下降(P<0.05)，見圖4、5。

圖4 弓形蟲感染對MLTC-1細胞睪酮合成相關酶蛋白的免疫印跡結果Fig.4 Results of Western blot for proteins involved in testosterone synthesis in MLTC-1 cells infected with Toxoplasma gondii

A.CYP171在不同時間下的相對表達量；B.3β-HSD在不同時間下的相對表達量；C.CYP11A1在不同時間下的相對表達量；D.StAR 在不同時間下的相對表達量。A.Relative expression of CYP171 at different times;B.Relative expression of 3β-HSD at different times;C.Relative expression of CYP11A1 at different times;D.Relative expression of StAR at different times.圖5 ImageJ統(tǒng)計學分析弓形蟲感染對MLTC-1細胞睪酮合成相關酶蛋白的免疫印跡結果Fig.5 ImageJ statistical analysis results of Western blot for proteins involved in testosterone synthesis in MLTC-1 cells infected withToxoplasma gondii

3 討論

睪酮是維持雄性第二性特征和促進精子發(fā)育成熟的重要性激素[10]。因此，睪酮的分泌量對雄性的生育能力至關重要。Lim A[11]等研究發(fā)現，弓形蟲感染能促進大鼠睪丸類固醇生成從而促進睪酮的合成，并推測這可能引起感染弓形蟲的雄性大鼠減少對貓的恐懼并提升對異性的吸引力，利于弓形蟲的傳播。姜楠[12]等研究發(fā)現，弓形蟲感染雄性小鼠后，小鼠血清中的睪酮含量先升高后降低。本試驗將弓形蟲與小鼠睪丸間質細胞進行共培養(yǎng)，持續(xù)觀察弓形蟲與睪丸間質細胞的狀態(tài)。結果發(fā)現，共培養(yǎng)1 h，大量弓形蟲開始接近MLTC-1細胞，3 h時大部分弓形蟲進入細胞，數量明顯增多，12 h時細胞中出現大量小泡，60 h時細胞局部大量破裂，說明弓形蟲可在短時間內進入細胞并引起病變。Jones TC[15]等同樣發(fā)現弓形蟲能迅速入侵細胞并導致細胞病變。

膽固醇作為睪丸間質細胞合成睪酮的重要原料，在類固醇激素合成酶的催化作用下，轉變?yōu)椴G酮[18-19]。膽固醇在StAR酶的作用下，從線粒體膜外轉運到線粒體內膜上，在內膜中，CYP11A1酶催化膽固醇裂解側鏈，將膽固醇轉變?yōu)樵邢┐纪M入內質網，并由不同酶催化轉變?yōu)橄鄳念惞檀技に?。孕烯醇酮?β-HSD的催化下轉變?yōu)樵型l(fā)生在滑面內質網上，未成熟的睪丸間質細胞不分泌睪酮，是因為產生的孕酮主要被CYP17A1催化轉變?yōu)樾巯┒l(fā)育成成熟的睪丸間質細胞后開始分泌睪酮，是由于雄烯二酮在17β-HSD的催化下轉變?yōu)椴G酮，此時合成的睪酮立即被釋放到細胞外[20]，因此可通過細胞上清來檢測睪酮分泌。本試驗通過Western blot檢測睪酮合成分泌過程中相關蛋白和酶的表達后發(fā)現，共培養(yǎng)9 h時，感染組的CYP11A1和3β-HSD的蛋白相對表達水平顯著下降，且12 h時CYP17A1的蛋白相對表達水平也顯著下降(P<0.05)。有研究發(fā)現，與類固醇激素合成有關的核受體，對睪酮的合成和分泌有直接而廣泛的調節(jié)作用[21]，因此推測，弓形蟲可能通過影響類固醇激素合成相關核受體的表達影響睪丸間質細胞分泌睪酮，后續(xù)還需進一步研究。

本試驗發(fā)現弓形蟲能在短時間內進入小鼠睪丸間質細胞，并刺激睪酮分泌，但隨感染時間的延長，弓形蟲會抑制類固醇激素合成相關酶的表達，抑制細胞的正常功能。