楊 慧，戴銘睿，于 洋,董雪純，羅宇航，戴金伯，曲 靜，郭麗穎，李俊芳，賀小英*

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014010;2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)礦業(yè)與煤炭學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014010)

稀土金屬礦業(yè)的開(kāi)發(fā)和利用給人類帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)對(duì)礦區(qū)周邊的生態(tài)環(huán)境以及人類健康造成了嚴(yán)重威脅[1]。以北方某稀土金屬冶選尾礦庫(kù)為例，其建造目的是用于存放大量的選礦廢水，由于早期建造時(shí)未考慮防滲漏裝置，導(dǎo)致庫(kù)內(nèi)污染物濃度逐年升高，且向地下不斷滲漏，污染了當(dāng)?shù)氐牡叵滤l(fā)了許多環(huán)境污染問(wèn)題[2]。ICR小鼠是當(dāng)今評(píng)估人類疾病健康的最佳模式動(dòng)物之一，由于它和人類的同源性較高，被廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)、腫瘤學(xué)及發(fā)育生物學(xué)等生命科學(xué)領(lǐng)域。我們前期研究發(fā)現(xiàn)尾礦庫(kù)滲漏導(dǎo)致地下水的污染會(huì)對(duì)SD大鼠的肝和腎細(xì)胞存在一定程度的毒理?yè)p傷[3]。因此，為進(jìn)一步評(píng)估尾礦庫(kù)滲透導(dǎo)致地下水污染對(duì)生物遺傳損傷的程度以及可能的分子機(jī)制。本文首先調(diào)查尾礦庫(kù)污染嚴(yán)重樣點(diǎn)地下水核心污染成分，其次系統(tǒng)研究受污染地下水對(duì)ICR小鼠在器官水平、細(xì)胞水平和基因水平的遺傳損傷效應(yīng)。本研究旨在為生物遺傳損傷手段能否科學(xué)有效地評(píng)價(jià)尾礦庫(kù)周邊地下水環(huán)境質(zhì)量提供新依據(jù)，同時(shí)為揭示尾礦庫(kù)周邊地下水污染對(duì)生物體遺傳損傷的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR雌性小鼠，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，在內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，通風(fēng)良好，溫度20℃～25℃，濕度50%～60%，自由采食。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源和使用嚴(yán)格遵循動(dòng)物倫理要求。

1.1.2 主要試劑 DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司；胰酶購(gòu)自索萊寶公司；鏈霉素和青霉素購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；磷酸緩沖液(PBS)、無(wú)水乙醇和二甲苯等購(gòu)自國(guó)藥公司；福爾馬林、HE染液等購(gòu)自索萊寶公司。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(Galaxy S型)，RS BIOTECH公司產(chǎn)品；熒光倒置顯微鏡(AE30/31+型)，日本尼康株式會(huì)社產(chǎn)品；電泳儀(Tanon EPS 300型)，上海天能科技有限公司；制冰機(jī)(XD-100 kg型)，華豫兄弟(深圳)制冰系統(tǒng)智能科技有限公司產(chǎn)品；水浴鍋(Thermo Scientific型)，萊恩德智能科技有限公司產(chǎn)品；分析天平(MP6001型)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；切片機(jī)(HistoCore MULGTICUT型)，徠卡儀器有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖水平電泳槽(DYCP-1型)，南京馳順科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；激光共聚焦顯微鏡，尼康儀器(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 水樣采集和水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定 本研究的水樣采集點(diǎn)為中國(guó)北方某尾礦庫(kù)，該尾礦庫(kù)于1965年投產(chǎn)，東西約3.0 km，南北約3.5 km，總體占地面積約11 km2，是中國(guó)最大的尾礦庫(kù)之一。根據(jù)距尾礦庫(kù)遠(yuǎn)近距離不同，選取具有代表性的尾礦庫(kù)滲漏水3個(gè)樣點(diǎn)，樣品的檢測(cè)指標(biāo)為:(1)離子：F，Cl，N，SO，Na，K，Mg，Ca；(2)稀土元素：La，Ce，Sc，Y，Nb，Pr，Nd，Sm，Dy；(3)金屬：Cu，Zn，Pb，Cd，Cr，Mn，Co，Ni及微量元素。根據(jù)中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)局制定的地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB 3838-2002)和地下水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 14848-2017)作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行水樣分析。所有分析均有效重復(fù)3次，所有樣品的測(cè)量誤差均≤5%。水樣由核工業(yè)北京地質(zhì)研究院分析測(cè)試研究中心(NexION 300D型ICP-電感耦合離子體質(zhì)譜儀)測(cè)定完成。

1.2.2 ICR小鼠的水處理 選取6周齡～8周齡ICR小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分組，每組5只～6只，采用3個(gè)采樣點(diǎn)S1組、S2組和S3組作為實(shí)驗(yàn)組，以本市標(biāo)準(zhǔn)生活飲用自來(lái)水作為對(duì)照組(S組)。ICR小鼠每4 h灌胃一次水樣，每次0.4 mL；飼養(yǎng)周期為30 d，各組的飼養(yǎng)食物及生長(zhǎng)環(huán)境均一致。

1.2.3 解剖處理ICR小鼠肝臟 試劑、容器、器械提前4 ℃預(yù)冷，采用頸椎脫臼法處死ICR小鼠后，立即放入裝有750 mL/L酒精的燒杯中，浸泡3 min后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞無(wú)菌室，將小鼠放在預(yù)先滅菌的玻璃培養(yǎng)皿中，先剖開(kāi)小鼠腹部皮膚，然后更換剪刀和鑷子剪開(kāi)小鼠腹壁，換用全新的鑷子和剪刀取出肝臟，以免造成交叉感染，于一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿多次清洗，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 臟器系數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 ICR小鼠飼養(yǎng)30 d后，各組隨機(jī)取出3只，測(cè)量ICR小鼠體重后頸椎脫臼處死，獲得ICR小鼠肝臟后用生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分后稱重肝組織重量，參照[4]計(jì)算肝臟臟器系數(shù)。采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異性比較，顯著性表示為*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.5 異常組織病理學(xué)分析 ICR小鼠在喂養(yǎng)30 d時(shí)，頸椎脫臼處死，解剖ICR小鼠后對(duì)肝臟病理學(xué)切片的分析采取采用蘇木精-伊紅(HE)染色的方法進(jìn)行[5]。

1.2.6 單細(xì)胞凝膠電泳 取上述獲得的S3，S1和S組ICR小鼠肝組織放入5 mL盛不含Ca2+、Mg2+的PBS的小燒杯中，采用無(wú)菌型眼科剪刀，將組織切碎至1 mm3，將細(xì)胞懸浮物用200目篩網(wǎng)過(guò)濾，然后在離心管中以1 000 r/min的速度進(jìn)行離心，5 min后，將上清液丟棄，如此反復(fù)3次。顯微鏡下計(jì)數(shù)，將細(xì)胞的濃度調(diào)節(jié)到每毫升1×106～1×107個(gè)，采用單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)判斷不同組織的DNA損傷程度。通過(guò)制膠、裂解及電泳，進(jìn)行染色及觀察。使用100 W汞燈作為熒光光源，在熒光顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)為549 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm)下，損傷的細(xì)胞DNA呈現(xiàn)由圓形、致密紅色核心(彗頭)和朝向陽(yáng)極的尾端DNA碎片(彗尾)構(gòu)成的“彗星”。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析尾礦庫(kù)周邊水(樣點(diǎn)S1、樣點(diǎn)S2、樣點(diǎn)S3、和對(duì)照組樣點(diǎn)S)對(duì)ICR小鼠在各細(xì)胞水平的損傷影響。

1.2.7 透射電鏡觀察ICR小鼠肝細(xì)胞 將礦區(qū)污染樣點(diǎn)水S3，S1和對(duì)照組S組處理ICR小鼠獲得的肝組織切碎至切成1 mm3的小塊，1 min內(nèi)固定于組織及細(xì)胞電鏡專用25 mL/L戊二醛固定液。采用透射電鏡檢測(cè)肝組織，通過(guò)分析肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的損傷程度來(lái)判斷實(shí)驗(yàn)水樣對(duì)細(xì)胞內(nèi)部組份的影響程度。本試驗(yàn)由武漢邁斯普生物科技有限公司完成。

1.2.8 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析 將礦區(qū)污染最嚴(yán)重的樣點(diǎn)水S3組與對(duì)照組S組處理30 d的ICR小鼠，提取肝細(xì)胞總RNA，利用IlluGmina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行了DNA文庫(kù)的建立和序列分析，分析基因表達(dá)譜變化，通過(guò)KEGG富集分析對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，進(jìn)一步研究ICR小鼠肝細(xì)胞在基因水平的損傷影響，本試驗(yàn)由南京派森諾基因科技有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1 水樣采集和水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

本研究采用地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB 3838-2002)和地下水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 14848-2017)評(píng)估采集樣本的質(zhì)量，結(jié)果表明在送檢的實(shí)驗(yàn)組水樣中F，Cl，N，SO，Na，K，Mg，Ca等離子的含量明顯高于對(duì)照組S組(P<0.05)，尤其是F，Cl離子的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)(表1)。

表1 稀土尾礦庫(kù)附近樣品中水質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定Table 1 Determination of water quality index in samples near rare earth tailings pond

2.2 臟器系數(shù)分析

為了進(jìn)一步確定實(shí)驗(yàn)過(guò)程對(duì)ICR小鼠的肝器官損傷效應(yīng)的影響，實(shí)驗(yàn)處理30 d后正常稱量ICR小鼠體重后解剖，將獲得的肝組織稱重并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)算臟器系數(shù)，使用SPSS軟件采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異性比較。結(jié)果如圖1所示，根據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，肝體比總體呈先上升后降的趨勢(shì)，且S1組肝體比呈顯著升高。

圖1 地下水污染對(duì)ICR小鼠肝體比的影響Fig.1 Effect of groundwater pollution on liver body ratio of ICR mice

2.3 肝組織HE染色觀察

肝臟組織HE染色結(jié)果如下圖2所示，S組ICR小鼠肝結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊呈索狀且形態(tài)清晰、核膜完整，中央靜脈、肝小葉、肝竇、肝索結(jié)構(gòu)清晰、著色均勻。與對(duì)照組相比，S3組肝臟出現(xiàn)鐵血黃素沉積(圖2中1)；出現(xiàn)組織間隙(圖2中2)和細(xì)胞損傷(圖2中3)明顯比對(duì)照組大。這一結(jié)果提示尾礦庫(kù)周邊地下水對(duì)ICR小鼠的肝臟在組織水平存在一定程度的損傷效應(yīng)。

a.S組ICR小鼠肝臟HE染色觀察；b.S3組ICR小鼠肝臟HE染色觀察a.HE staining of liver in ICR mice in group S;b.S3 group ICR mice liver HE staining observation圖2 地下水污染ICR小鼠肝HE染色觀察Fig.2 Observation of HE staining liver sections of ICR mice polluted by groundwater

2.4 單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)DNA損傷

由圖3可知，S組ICR小鼠肝細(xì)胞DNA為圓形，沒(méi)有產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，而S3組ICR小鼠肝細(xì)胞DNA產(chǎn)生了不同程度拖尾現(xiàn)象，即彗星狀。隨著污染程度加重，肝細(xì)胞的DNA拖尾程度越嚴(yán)重，且尾部DNA %增大。統(tǒng)計(jì)分析表明，與S組相比，S1和S3組彗星數(shù)量顯著性升高(P<0.01)，且隨著污染程度加重，說(shuō)明DNA損傷率同樣也呈遞增趨勢(shì)。

圖3 單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)DNA損傷Fig.3 Single cell gel electrophoresis for detection of DNA damage

2.5 透射電鏡觀察ICR小鼠肝細(xì)胞

為研究受污染地下水對(duì)ICR小鼠肝臟細(xì)胞器的影響，選取S3、S1和S組利用透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。如圖5所示，S組肝組織結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常，線粒體結(jié)構(gòu)完整無(wú)空泡化現(xiàn)象。與S組相比，S1組肝臟線粒體脊線邊界不清晰(圖5中a、b)，S3組肝臟出現(xiàn)自噬溶酶體(圖5中c)，線粒體腫脹且脊線紊亂(圖5中d、e)。結(jié)果證明，尾礦庫(kù)周邊地下水會(huì)ICR小鼠的肝臟在線粒體等超微結(jié)果中存在一定程度的生物損傷效應(yīng)。

圖4 透射電鏡觀察ICR小鼠肝細(xì)胞Fig.4 The hepatocytes of ICR mice were observed by transmission electron microscope

圖5 ICR小鼠肝臟基因差異表達(dá)Fig.5 Differential gene expressions in liver of ICR mice

2.6 ICR小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

2.6.1 基因差異表達(dá)情況 為進(jìn)一步系統(tǒng)分析礦區(qū)周邊滲漏地下水對(duì)ICR小鼠肝臟損傷的分子機(jī)制，選取尾礦庫(kù)受污染最嚴(yán)重庫(kù)內(nèi)水S3組水樣喂養(yǎng)ICR小鼠30 d后，處死小鼠后將肝組織送轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，如火山圖6所示，30 d時(shí)S3組肝臟組織中有135個(gè)上調(diào)基因，95個(gè)下調(diào)基因。

2.6.2 KEGG富集分析 對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果如圖7所示，飼喂S3組水樣的ICR小鼠肝臟差異基因主要富集在：MAPK信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工，癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、FoxO信號(hào)通路、以及多種癌變通路等方面。

a.S3組處理30 d時(shí)ICR 小鼠肝臟 KEGG 氣泡圖；b.S3組處理30 d時(shí)ICR 小鼠肝臟 KEGG 柱狀圖a.KEGG bubble plot of liver in ICR mice treated with S3 for 30 d;b.Bar graph of KEGG columns in liver of ICR mice treated with S3 for 30 d圖6 ICR小鼠肝臟KEGG富集分析Fig.6 Enrichment analysis of KEGG in liver of ICR mice

3 討論

肝臟是脊椎動(dòng)物身體內(nèi)主要的新陳代謝器官，發(fā)揮著脫氧、儲(chǔ)存肝糖和分泌蛋白的合成等身體必須的功能[6]，并且在多種復(fù)雜生化過(guò)程中如維生素的活化和儲(chǔ)存，胚胎期的造血功能中承擔(dān)重要角色[7]。由于肝臟內(nèi)含有一種活性的金屬硫蛋白，導(dǎo)致有毒物質(zhì)最容易積累于肝臟[8]，有毒物質(zhì)能影響肝臟中的酶活力[9]，同時(shí)也能引起肝細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷[10]。張娜等報(bào)道可通過(guò)抵抗線粒體損傷保護(hù)肝細(xì)胞[11]，有研究表明鐵血紅素沉積會(huì)使器官功能受損[12]，張曉莉等報(bào)道發(fā)現(xiàn)中老年犬肝臟間隙增大[13]。有研究表明，一些稀土金屬礦區(qū)泄漏造成的地下水污染的核心污染成分不是重金屬，而是大量的鹽離子[3]。因此，評(píng)估有毒污染物對(duì)生物體肝臟的損傷具有重要的意義。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)尾礦庫(kù)污染地下水中主要的污染因子仍是之前報(bào)道的鹽離子，如F-、Cl-等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，礦區(qū)周邊滲漏導(dǎo)致的地下水污染能夠?qū)е赂闻K的結(jié)構(gòu)不完整，隨著污染程度加重肝體比呈先升后降的趨勢(shì)。組織水平HE鑒定結(jié)果表明，試驗(yàn)組出現(xiàn)鐵血紅素沉積、細(xì)胞損傷和間質(zhì)間隙增大。從肝組織制備單細(xì)胞懸液進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNA損傷率，發(fā)現(xiàn)S3組ICR小鼠肝細(xì)胞DNA產(chǎn)生了不同程度拖尾現(xiàn)象，即彗星狀。隨著污染程度加重，肝細(xì)胞的DNA拖尾數(shù)目增多程度越大，說(shuō)明DNA損傷率同樣也呈遞增趨勢(shì)。通過(guò)透射電鏡觀察肝細(xì)胞發(fā)現(xiàn)與S組相比，S3組處理之后肝細(xì)胞出現(xiàn)線粒體脊線不連貫且出現(xiàn)線粒體空泡化的現(xiàn)象。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，樣點(diǎn)S3喂養(yǎng)30 d的ICR小鼠，肝組織中有135個(gè)上調(diào)基因，95個(gè)下調(diào)基因。差異基因進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)飼喂S3組水樣的ICR小鼠肝臟差異基因主要富集在MAPK信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工，癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、FoxO信號(hào)通路以及多種癌變通路等方面。因此，本研究初步證實(shí)ICR小鼠肝功能遺傳損傷研究的分子機(jī)制，后續(xù)有待進(jìn)一步建立肝細(xì)胞模型深入研究。