石亞其 雷玉華 王 勇 張 倩

（湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000）

我國血管疾病的發(fā)生率和病死率不斷上升，給社會帶來了沉重的醫(yī)療負擔［1］。急性心肌梗死（AMI）在心血管疾病中最為嚴重，尋找安全有效的AMI防治策略具有重要的臨床意義［2］。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是新近發(fā)現(xiàn)的炎癥介質(zhì)，由215個氨基酸構(gòu)成，包含2個同源性DNA結(jié)合區(qū)（A盒和B盒）以及一個負性C末端［3］。HMGB1幾乎存在于所有細胞的細胞核和細胞質(zhì)中，是一種高度進化保守的非組蛋白DNA結(jié)合蛋白。HMGB1作為DNA伴侶能穩(wěn)定核小體，參與DNA的復制和修復，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)甾體類激素受體的活性等［4］。心肌缺血時，HMGB1可由壞死和損傷的心肌細胞被動釋放，或由活化的單核/巨噬細胞主動分泌，升高的HMGB1通過激活下游信號通路直接誘導合成分泌白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子，進一步損傷心肌組織［5］。胡椒堿是黑胡椒與長胡椒中的一種酚類物質(zhì)，能夠發(fā)揮抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多重藥理功效［6］。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)胡椒堿可通過減輕炎癥反應而改善缺血性心肌病損傷，但目前針對胡椒堿防治AMI的研究甚少［7］。因此，本研究擬觀察胡椒堿對AMI大鼠的心臟保護作用并探究其對HMGB1、IL-1β和IL-6水平的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只SPF級雄性SD大鼠（年齡8周），購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物合格證號：11400700041438，動物許可證號：SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)環(huán)境光線明暗交替，濕度（40±10）%，溫度（25±2）℃。本實驗經(jīng)過恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院倫理審查委員會的批準（批準號：20200012A）。

1.2 試藥與儀器

胡椒堿（純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司，貨號：A0200）。IL-1β ELISA試劑盒（Elabscience公司，貨號：E-EL-R0012c）；IL-6 ELISA試劑盒（Sigma公司，貨號：RAB0311）；HMGB1 ELISA 試劑盒（Elabscience公司，貨號：E-EL-R0505c）；TTC試劑（Sigma公司，貨號：17779）。電子天平（上海良品儀器廠）；低溫高速離心機（日本Hitachi公司）；石蠟包埋機及切片機（德國Leica公司）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）；多功能圖像分析系統(tǒng)（德國Leica公司）；酶標儀（美國Bio-Rad公司）；小動物呼吸機（上海奧爾科特公司）；獸用心電圖機（理邦精密儀器公司）；渦旋震蕩儀（無錫沃信儀器制造有限公司）。

1.3 分組與造模

將SD大鼠60只隨機分為5組，每組12只，即假手術(shù)組、模型組、胡椒堿低劑量組（10 mg/kg）、胡椒堿中劑量組（20 mg/kg）、胡椒堿高劑量組（30 mg/kg）。從胸骨左緣第3～4肋打開胸腔暴露心臟，用4-0絲線穿過大鼠左室前降支（LAD）起始部，通過拉緊絲線方式阻斷LAD，心電圖示ST-T抬高提示建模成功。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，腹腔麻醉大鼠，行氣管插管，監(jiān)測大鼠心電圖情況。

1.4 給藥方法

在AMI模型建立成功后即刻，胡椒堿低、中、高劑量組分別予胡椒堿10、20、30 mg/kg，假手術(shù)組、模型組給予10 mL/kg的生理鹽水，連續(xù)灌胃7 d。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 TTC染色檢測心肌梗死面積 末次給藥后2 h，用2%戊巴比妥鈉3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，充分暴露大鼠右頸靜脈，然后從右頸靜脈緩慢推入約1 mL TTC液。15 min后從右頸靜脈推入10%氯化鉀1 mL并取出心臟，-80℃條件下冰凍10 min。取出心臟，沿垂直心臟左室長軸縱向切成2 mm左右的薄片，并將心臟切片放入多聚甲醛中固定顯色，最終白色為梗死區(qū)域，根據(jù)白色區(qū)域面積占比大小評估梗死情況。

1.5.2 病理形態(tài)學分析大鼠心肌損傷 4%多聚甲醛固定心肌組織72 h后，將心肌組織經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋等過程制成石蠟塊。制作的石蠟切片經(jīng)蘇木精及伊紅染色后，用二甲苯和無水乙醇透明，透明的切片最后滴上中性樹脂封片，并在光學顯微鏡下觀察。

1.5.3 ELISA法測定HMGB1、IL-1β及IL-6水平 將心肌組織勻漿后，以2 000 r/min，4℃條件下離心20 min，留取上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測上清液中HMGB1、IL-1β及IL-6水平。

1.6 分子對接

使用Autodock Vina 1.1.2進行分子對接，以研究胡椒堿與HMGB1之間的結(jié)合情況。從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）下載HMGB1的3D結(jié)構(gòu)（PDB ID：4QR9）。從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載（https：//old.tcmspe.com/tcmsp.php）胡椒堿（Molecule ID：MOL001592）的3D結(jié)構(gòu)。運用AutoDockTools軟件將胡椒堿與HMGB1進行分子對接，通過Flexible Docking模塊分析分子間的結(jié)合位點及能量。設(shè)置參數(shù)時，“能量最大評價次數(shù)”設(shè)定為2 500 000，運行次數(shù)設(shè)定為10，其他參數(shù)為默認值。使用PyMoL進行可視化分析（http：//www.pymol.org/）。

1.7 統(tǒng)計學處理

應用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示。多組差異比較采用單因素方差分析，組間差異進行t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織病理改變

相較于假手術(shù)組，手術(shù)組心肌變性紊亂，細胞間質(zhì)水腫，同時伴有炎性細胞浸潤。胡椒堿預處理能使心肌病理得到較好的改善，且這種改善呈劑量依賴性。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理改變（HE染色，100倍）

2.2 各組大鼠心肌梗死面積比較

見表1。TTC檢測心肌梗死面積發(fā)現(xiàn)，胡椒堿各劑量組心肌梗死面積小于模型組，有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05），且梗死面積胡椒堿高劑量組＜中劑量組＜低劑量組。

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較（%，±s）

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較（%，±s）

注：與模型組比較，#P＜0.05；與胡椒堿低劑量組比較，*P＜0.05；與胡椒堿中劑量組比較，&P＜0.05。下同。

組別假手術(shù)組模型組胡椒堿低劑量組胡椒堿中劑量組胡椒堿高劑量組n5 5 5 5 5心肌梗死面積0 56.78±8.98 45.12±6.03#38.17±4.91#*30.36±3.92#*&

2.3 各組大鼠心肌HMGB1、IL-1β及IL-6水平比較

見表2。與假手術(shù)組相比，模型組HMGB1、IL-1β及IL-6表達水平升高（均P＜0.05）。胡椒堿預處理能呈劑量依賴性地降低HMGB1、IL-1β及IL-6表達水平（均P＜0.05）。

表2 各組大鼠HMGB1、IL-1β、IL-6表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠HMGB1、IL-1β、IL-6表達水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組胡椒堿低劑量組胡椒堿中劑量組胡椒堿高劑量組n 5 5 5 5 5 HMGB1（μg/L）74.08±4.11 145.24±10.45△130.99±8.58#△114.82±7.05#△*100.33±6.12#△*&IL-1β（ng/L）0.66±0.18 2.65±0.69△1.83±0.55#△1.32±0.37#△*1.01±0.23#△*&IL-6（ng/L）0.45±0.06 1.43±0.31△1.05±0.18#△0.83±0.16#△*0.68±0.07#△*&

2.4 胡椒堿可靶向結(jié)合HMGB1

采用分子對接方法分析了胡椒堿與HMGB1的結(jié)合能力，兩者之間的結(jié)合能預測為-8.01 kcal/mol，這提示胡椒堿可靶向結(jié)合HMGB1。見圖2。

圖2 胡椒堿可靶向結(jié)合HMGB1

3 討論

本研究結(jié)果表明，AMI后心肌HMGB1、IL-1β及IL-6水平顯著增高，而胡椒堿呈劑量依賴性地縮減心肌梗死面積，改善心肌細胞變性壞死，降低HMGB1、IL-1β及IL-6水平。同時分子對接分析表明胡椒堿與HMGB1有較強的靶向結(jié)合能力。這些結(jié)果表明，胡椒堿能對AMI后的心肌發(fā)揮保護作用，其作用可能是通過靶向結(jié)合HMGB1，降低HMGB1、IL-1β及IL-6的表達來實現(xiàn)的。

大量實驗研究已證實，IL-1β、IL-6等炎性因子在心肌IRI的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用［8］。HMGB1被證實為一種含量豐富的非組蛋白核蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移率快的特性而得名，HMGB1在細胞內(nèi)可促進基因轉(zhuǎn)錄，穩(wěn)定核小體、促進DNA重組、復制和折疊，調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程［9］。當HMGB1釋放到細胞外成為機體的一種“危險信號”時，即可在許多嚴重炎癥性疾病中扮演至關(guān)重要的角色，比如敗血癥、急性肺損傷、風濕性關(guān)節(jié)炎等［10-12］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在心肌梗死及心肌缺血再灌注損傷等心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中同樣起著重要的作用［13-14］。最近，我們的研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定型心絞痛和不穩(wěn)定型心絞痛患者血清HMGB1表達明顯增高，并且與冠狀動脈狹窄程度成正相關(guān)。Dong等［15］證實缺血再灌注大鼠心肌HMGB1的表達與IL-1β和IL-6的表達成顯著正相關(guān)，進一步表明HMGB1可促進多種炎癥因子的表達和釋放。此外，有研究證實IL-6能夠刺激巨噬細胞釋放HMGB1并呈時間和劑量依賴性，表明兩者可以形成正反饋，共同促進炎癥發(fā)展［16］。以上研究結(jié)果提示HMGB1與其他促炎因子之間存在著一種相互促進釋放的正反饋效應，可在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。

相關(guān)理論認為，AMI等缺血性心肌病存在血瘀病證。多項藥理研究表明，胡椒堿具有通瘀血，改善缺血性損傷及抗炎等藥理活性［17］。Guo等發(fā)現(xiàn)胡椒堿可通過減輕炎癥反應而對大鼠冠脈結(jié)扎后引起的心肌缺血損傷發(fā)揮保護作用［18］。宋思維等報道胡椒堿可有效降低過氧化氫所致心肌細胞炎癥反應［19］。本研究結(jié)果表明，胡椒堿可以降低AMI后心肌中HMGB1、IL-1β及IL-6的高表達，從而減小心肌梗死面積，發(fā)揮心肌保護作用。

分子對接作為一種研究藥物分子和受體之間相互作用的方法，可從理論上模擬并預測藥物分子與受體的結(jié)合模式和親合力，已成為計算機輔助藥物研究領(lǐng)域的一項重要技術(shù)［20］。一般來說，分子與靶點結(jié)合能越低表示分子間結(jié)合得越穩(wěn)固，交互作用可能性越高，結(jié)合能＜0 kcal/mol時分子與靶點具有結(jié)合能力，結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol時結(jié)合得較好，結(jié)合能≤-7.5 kcal/mol結(jié)合得非常好［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，胡椒堿與HMGB1兩者之間的結(jié)合能為-8.01 kcal/mol，這提示胡椒堿可很好地靶向結(jié)合HMGB1從而影響其介導的促炎因子釋放。胡椒堿對HMGB1的直接靶向作用進一步解釋了胡椒堿降低AMI心肌中HMGB1及相關(guān)炎癥因子表達的原因?？傊?，本研究初步探討了胡椒堿對AMI心肌的保護作用及可能的機制，為AMI的藥物治療提供了新思路。