史 葉 蔡春芳* 亢 佳 胡鴻林 曹霞敏 吳 萍 葉元土 丁惠明

(1. 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，蘇州215123；2. 蘇州大學(xué)江蘇省水產(chǎn)動物營養(yǎng)重點實驗室，蘇州215123；3. 蘇州市陽澄湖國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范區(qū)發(fā)展有限公司，蘇州215138)

除了粗纖維，植物性飼料中還含有大量其他的不可被單胃動物消化的碳水化合物。世界衛(wèi)生組織和中國營養(yǎng)學(xué)會將這一類物質(zhì)定義為膳食纖維(dietary fiber，DF)[1]，包括非淀粉多糖(纖維素、半纖維素、果膠、樹膠、β-葡聚糖等)，抗性淀粉，抗性低聚糖等[2]。水產(chǎn)配合飼料中常用的植物性蛋白質(zhì)源豆粕、棉籽粕、菜籽粕中粗纖維含量分別為3.61%、10.12%[3]、10.95%[4]，但其DF含量分別高達(dá)36.7%[5]、34.0%、35.4%[6]，豆渣中DF含量更是高達(dá)62.9%[7]，可見這些蛋白質(zhì)源中DF含量僅次于甚至高于蛋白質(zhì)含量。醫(yī)學(xué)研究表明，適量的DF具有降膽固醇[8]、降血脂[9]、改善腸道菌群[10]、提高機(jī)體免疫力的作用[11]。然而，近年的研究表明，DF高載會引起小鼠[12]和魚類[13-14]炎性反應(yīng)和組織損傷。由于魚粉資源的短缺[15]，水產(chǎn)飼料中植物性蛋白質(zhì)源的用量越來越高[16]，使養(yǎng)殖動物DF負(fù)載長期處于較高狀態(tài)。DF高載可能是養(yǎng)殖魚類疾病多發(fā)的重要原因[13-14,17]。

攝食的第一需要是滿足能量的需要[18]，在高DF飼料中提高脂肪水平，飼料可消化能提高，這會降低養(yǎng)殖魚類采食量[19]，從而降低了DF攝入量，這樣或可緩解由DF高載引起的炎癥反應(yīng)和肝纖維化。因為DF的生理效應(yīng)與其和膽汁酸的結(jié)合力、黏性及可發(fā)酵性等性質(zhì)有關(guān)[20]。瓜爾膠黏性強(qiáng)，是常被用作研究DF營養(yǎng)生理的材料[21-22]。已有報道表明，瓜爾膠會抑制魚類生長速度，引起腸道損傷[23-24]。因此，本研究以大口黑鱸(Micropterussalmoides)為研究對象，在高DF瓜爾膠基礎(chǔ)飼糧中提高脂肪水平，研究其對炎癥反應(yīng)和組織損傷的影響，旨在為水產(chǎn)飼料配方優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

瓜爾膠(食品級，含量>99%)、干酪素均購自于浙江某生物科技有限公司，其他飼料原料均由廣東某飼料有限公司提供。

1.2 試驗飼糧

豆粕中DF含量為36.7%[5]，如果飼料中豆粕用量為30%，可帶入10.8%的DF，加上其他植物性原料帶入的DF，實用飼料中總DF含量可達(dá)15%。因此，本試驗配制DF含量均為15%，大豆油的添加量分別為3%(LL，實測脂肪水平為12.81%)和8%(HL，實測脂肪水平為17.94%)的2種飼糧。所有原料粉碎后按配方精確稱取，充分混合均勻，分批加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為20%的蒸餾水，混勻，制成直徑為1.8 mm、長度為5 mm左右的顆粒，將顆粒飼料密封保存于-20 ℃冰箱。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1 Items Diets LL HL Soybean meal15.0015.00 Squid paste2.002.00 Guar gum15.0015.00 Mineral premix1)1.501.50Vitamin premix2)1.501.50 Ca(H2PO4)21.501.50 Zeolite power5.200.20 Fish oil4.004.00 Soybean oil3.008.00 Phospholipid1.001.00 Total100.00100.00 Nutrient levels3) Moisture7.737.77 CP44.3344.35 EE12.8117.94 Ash 12.349.37 TDF4)20.5120.51 GE/(MJ/kg)19.2820.59

1.3 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

大口黑鱸幼魚購買自金澄福漁業(yè)科技有限公司，養(yǎng)殖試驗在蘇州市陽澄湖國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司研究生工作站進(jìn)行。試驗魚運回后在室內(nèi)養(yǎng)殖池暫養(yǎng)，每天表觀飽食投喂大口黑鱸商品飼糧(浙江粵海飼料有限公司，粗蛋白質(zhì)含量≥40%，粗脂肪含量≥3%，粗纖維含量≤8%)2次(09:00，16:00)，馴養(yǎng)2個月后，于禁食狀態(tài)下選取120尾規(guī)格一致且體質(zhì)健壯的幼魚，稱重后隨機(jī)分入6個容積為400 L的聚乙烯桶，桶中盛水300 L，每桶放魚20尾。用LL飼糧繼續(xù)馴化2周以適應(yīng)試驗條件。養(yǎng)殖試驗開始前，再稱重(此時平均體重為10.6 g/尾)并調(diào)整各缸魚重至變異系數(shù)<3%。將調(diào)整后的120尾魚分為2組，分別飼喂LL飼料和HL飼料，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)20尾。每天表觀飽食投喂2次(09:00，16:00)。飼養(yǎng)期間每天08：00采用虹吸法排污并換水約1/3，水溫在26～30 ℃，pH為7.7±0.1，溶解氧濃度確保高于6.5 mg/L，氨氮濃度維持在0.01 mg/L以下。飼喂56 d后進(jìn)行采樣。

1.4 樣品采集與處理

樣品采集前禁食24 h。采樣時將一桶魚迅速撈起，MS-222麻醉，稱總重，再將每條魚分別稱尾重、測體長。從每組中選取9尾魚(每桶隨機(jī)取3尾)液氮速凍，保存于-20 ℃中，用于全魚常規(guī)營養(yǎng)成分分析。每桶取3尾魚于無菌條件下分離肝臟和后腸，樣本放入1.5 mL滅酶滅菌離心管中，液氮速凍后放置于-80 ℃中保存，用于基因表達(dá)分析。其余的魚尾靜脈采血，將抽取的血液放置在1.5 mL離心管中，4 ℃靜置4 h后，3 000×g離心10 min，將離心后所得上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，保存在-80 ℃超低溫冰箱中，用于血清生化指標(biāo)的測定；將魚解剖，取出內(nèi)臟團(tuán)并稱重，分離出肝臟、膽囊、腸道，稱肝臟重量，用于計算臟體比(VSI)、肝體比(HSI)；將2尾魚的肝臟和后腸組織置于4%甲醛溶液中固定，4 ℃保存，用于肝臟病理學(xué)切片制備；其余的肝臟放在5 mL離心管中，液氮速凍，用于組織成分分析。

1.5 分析與計算方法

增重率(weight gain rate，WGR，%)=
100×(Wf-Wi)/Wi； 特定生長率(specific growth rate, SGR, %/d)=
100×(lnWf-lnWi)/t； 攝食率(feeding rate，F(xiàn)R，%)=100×F/
[t×(Wf+Wi)/2]； 飼料系數(shù)(feed conversion ratio, FCR)=
F/(Wf-Wi)； HIS(%)=100×Wh/Wb； VSI(%)=100×Wv/Wb； 肥滿度(condition factor, CF, g/cm3)=100×
Wb/L3。

式中：Wi為平均每尾魚初重(g)；Wf為平均每尾魚末重(g)；F為飼料攝入量干重(g)；t為養(yǎng)殖試驗期(d)；Wh為樣品魚肝臟重(g)；Wv為樣品魚內(nèi)臟重(g)；Wb為樣品魚體重(g)；L為樣品魚體長(cm)。

1.5.2 飼料和魚體成分

水分含量采用105 ℃烘箱干燥法(GB/T 6435—2014)測定(GZX-9030MBE,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；粗蛋白質(zhì)含量(GB/T 6432—2018)使用全自動凱氏定氮儀測定(SKD-1000,上海沛歐分析儀器有限公司)；粗脂肪含量采用索氏抽提法(GB/T 6433—2006)測定；粗灰分含量采用馬福爐灼燒法(GB/T 6438—2007)測定(80-10TP,上?；厶﹥x器制造有限公司)；肝臟脂肪含量采用氯仿甲醇法[25]測定；肝臟總蛋白含量采用試劑盒測定(南京建成生物工程研究所)；肝臟膠原蛋白含量采用試劑盒雙抗體夾心法測定(綠葉生物科技有限公司)；飼料總能采用氧氮式熱量計(SDACM5000,長沙三德科技有限公司)測定。

1.5.3 血清生化指標(biāo)

使用全自動血液生化分析儀(雅培C8000)測定血清總膽汁酸(TBA)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)活性。所用試劑盒均購自上海執(zhí)誠生物科技有限公司。

1.5.4 肝臟和后腸相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量

利用Trizol提取肝臟和后腸中RNA，提取后的RNA利用2%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，用核酸儀測定RNA的濃度。按照5XAll-In-One RT Master Mix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)(abm)試劑盒方法，合成cDNA后放置于-20 ℃冰箱中保存。實時熒光定量 PCR操作根據(jù)EvaGreen 2X qPCR Master Mix (abm)試劑盒說明書進(jìn)行。每個反應(yīng)體系共20 μL：6 μL分子級滅菌蒸餾水，2 μL稀釋混合后引物，2 μL稀釋后的cDNA模板以及10 μL的Eva Green 2X qPCR Master Mix。所用程序為：預(yù)變性95 ℃ 30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃運行30 s進(jìn)行退火和延伸，共進(jìn)行40個循環(huán)。試驗結(jié)果用2-ΔΔCt的方法分析定量相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量。實時熒光定量PCR引物序列見表2。

目前，光山縣的紅色文化資源主要以紀(jì)念館、博物館烈士陵園舊址紀(jì)念地、名人故居、名人墓等形式展示，有較強(qiáng)吸引力的參與性和體驗性項目很少。利用SCS理念，結(jié)合數(shù)字化展示技術(shù)，利用聲、光、電的形式，通過影視內(nèi)容，來營造震撼的視聽效果，采用VR技術(shù)，實現(xiàn)眼睛的穿越，讓游客深處會議中，戰(zhàn)爭中，切身感受革命戰(zhàn)爭故事。光山縣王大灣會議會址紀(jì)念館和鄧穎超祖居，采用播放相關(guān)影視劇和采訪實錄等形式，將劉鄧大軍千里躍進(jìn)大別山的艱難和鄧穎超大姐的光輝形象展示給游人，使游人在實地參觀的過程中，更加真切地體會和感受其紅色文化內(nèi)涵和魅力。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.5.5 肝臟和后腸組織切片

將肝臟和后腸組織按常規(guī)程序制作石蠟切片，對肝臟切片進(jìn)行馬松(Masson)染色，對后腸組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，采用光學(xué)顯微鏡(Olympus BX51)進(jìn)行觀察并采用其成像系統(tǒng)拍攝。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有試驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間的差異采用獨立樣本t檢驗對比分析。P<0.05為差異顯著。作圖軟件為Graphpad Prism 7.0。

2 結(jié) 果

2.1 高DF飼糧中脂肪水平對大口黑鱸幼魚生長性能的影響

由表3可知，與LL組相比，HL組大口黑鱸的WGR、SGR和CF顯著增加(P<0.05)，但FR、FCR、VSI和HSI在2組間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 高DF飼糧中脂肪水平對大口黑鱸幼魚體成分和肝臟脂肪含量的影響

由表4可知，2組間魚體粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量無顯著差異(P>0.05)。HL組和LL組間肝臟脂肪含量也無顯著差異(P>0.05)。

表3 高DF飼糧中脂肪水平對大口黑鱸幼魚生長性能的影響

表4 高DF飼糧中脂肪水平對大口黑鱸幼魚體成分和肝臟脂肪含量的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.3 高DF飼糧中脂肪水平對大口黑鱸幼魚血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，HL組血清ALT活性顯著低于LL組(P<0.05)，而血清AST、ALP活性及TP、ALB、GLOB、CHO、TG、LDL和HDL含量2組間無顯著差異(P>0.05)。

表5 高DF飼糧中脂肪水平對大口黑鱸幼魚血清生化指標(biāo)的影響

2.4 高DF飼糧中脂肪水平對大口黑鱸幼魚肝臟和后腸炎性基因表達(dá)的影響

由圖1可知，HL組肝臟核因子-κβ(NF-κβ)和后腸NF-κβ、腫瘤壞死因子α (TNFα)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ) mRNA相對表達(dá)量顯著低于LL組(P<0.05)，而肝臟TGFβmRNA相對表達(dá)量顯著高于LL組(P<0.05)

NF-κβ：核因子-κβ nuclear factor kappa-β；TNFα：腫瘤壞死因子α tumor necrosis factor α；IL-10：白細(xì)胞介素-10 interleukin-10； TGFβ：轉(zhuǎn)化生長因子β transforming growth factor β。

2.5 高DF飼糧中脂肪水平對大口黑鱸幼魚肝臟脂質(zhì)代謝和膽汁酸受體基因表達(dá)的影響

由圖2可知，HL組肝臟過氧化物酶增殖體激活受體α(PPARα)、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)和脂蛋白A1(APOA1) mRNA相對表達(dá)量顯著高于LL組(P<0.05)，肝臟脂肪酸合成酶(FAS)和脂蛋白B(APOB) mRNA相對表達(dá)量在HF組和LL組間差異不顯著(P>0.05)。肝臟法尼醇X受體(FXR)和G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5(TGR5) mRNA相對表達(dá)量與LL組無顯著差異(P>0.05)，但存在下降趨勢。

PPARα: 過氧化物酶增殖體激活受體α peroxisome proliferators-activated receptor α; FAS：脂肪酸合成酶 fatty acid synthase；CPT1：肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1 carnitine palmitoyltransferase 1；APOA1: 脂蛋白A1 apolipoprotein A1; APOB: 脂蛋白B apolipoprotein B; FXR: 法尼醇X受體 farnesoid X receptor; TGR5: G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體 G protein-coupled bile acid receptor。

2.6 高DF飼糧中脂肪水平對大口黑鱸幼魚肝腸組織學(xué)的影響

由圖3可知，后腸組織切片顯示2組魚的腸道絨毛均較完整，未見明顯組織損傷。馬松染色的肝臟組織切片中可觀察到HL組肝細(xì)胞間藍(lán)色信號明顯比LL組弱。由圖4可知，HL組肝臟膠原纖維含量顯著低于LL組(P<0.05)。

a和b為LL組和HL組后腸HE染色切片(200×)；c和d為LL組和HL組肝臟MASSON染色切片(400×)。

圖4 高DF飼糧中脂肪水平對大口黑鱸

3 討 論

本研究結(jié)果表明，飼養(yǎng)8周后，大口黑鱸的尾增重15～17 g。彭祥和[32]的研究表明，以不同脂肪水平飼喂規(guī)格11.9 g的大口黑鱸，養(yǎng)殖56 d后魚體增重在18～25 g。這表明無論飼料脂肪水平高低，DF高載均對魚體生長具有抑制作用。已有研究表明，當(dāng)飼糧中脂肪水平在12%～18%時，河鱸(Percafluviatilis)的生長性能隨著飼糧中脂質(zhì)含量的提高而改善[33]，飼糧脂肪水平在35%以下時，高首鱘(Acipensertransmontanus)的生長表現(xiàn)與飼糧脂肪水平呈正相關(guān)關(guān)系[34]。本研究表明，HL組大口黑鱸的SGR顯著高于LL組，與上述報道結(jié)果相一致，表明魚類對脂肪具有較好的利用能力。Chen等[35]報道大口黑鱸適宜的飼糧脂肪水平為11.5%～14%。Huang等[36]推薦大口黑鱸的脂肪水平為12%。本研究LL組和HL組飼糧的脂肪水平分別為12.81%和17.94%，而HL組SGR顯著高于LL組，提示大口黑鱸幼魚飼糧適宜的脂肪水平可能高于現(xiàn)有文獻(xiàn)報道，也可能飼糧中適宜的脂肪水平還受DF含量的影響。

DF具有結(jié)合膽汁酸[26]、降低膽汁酸的生物學(xué)效價[42-43]和阻礙膽汁酸重吸收率的作用[44]，從而使膽汁酸受體FXR/TGR5的活性受到影響，而FXR/TGR5參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[45]。Ni等[26]報告高DF飼糧導(dǎo)致大口黑鱸肝臟FXR表達(dá)下降，致炎因子基因表達(dá)上調(diào)。本研究中未檢測到2組魚間FXR和TGR5 mRNA相對表達(dá)量的顯著變化，但HL組肝臟組織中致炎因子基因NF-κβmRNA相對表達(dá)量高于HL組，對炎癥反應(yīng)有一定的抑制作用[46]的TGFβ的mRNA相對表達(dá)量低于HL組。由于2組魚的FR差異不顯著，甚至HL組FR略高于LL組，因此，HL組較弱的炎性反應(yīng)不是DF攝入量減少的緣故，可能是高水平脂肪緩解了炎性反應(yīng)。當(dāng)飼糧中DF含量相同時，較高的脂肪水平可能會降低DF的粘性[47]，從而削弱DF對膽汁酸的結(jié)合作用，這可能是HL組炎性反應(yīng)較弱的原因所在。炎性反應(yīng)會引起肝臟組織損傷和纖維化[48]。本研究中肝臟組織切片MASSON染色后顯示，HL組肝臟纖維化較LL輕，反映肝臟氧化損傷的血清ALT活性也是HL組顯著低于LL組，表明HL組肝臟組織損傷較輕，與炎性反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果相一致。

PPARα是脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，誘導(dǎo)脂肪酸氧化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶CPT1的表達(dá)[49]，進(jìn)而改善線粒體和過氧化物酶體的脂肪酸氧化[50]。載脂蛋白APOA1是HDL-C的主要成分。HDL-C能將膽固醇從外周細(xì)胞運送到肝臟代謝，從而降低脂質(zhì)積累[51]。本研究中HL組PPARα、CPT1和APOA1的mRNA相對表達(dá)量顯著高于LL組，這與Huang等[52]、Guilmeau等[53]的研究結(jié)果相一致，表明飼糧脂肪水平較高時，脂肪酸的轉(zhuǎn)運及氧化分解加快。本研究中HL組不僅HSI與LL組無顯著差異，肝臟脂肪含量也并沒有升高，甚至還略低于LL組，可能是因為攝入的高水平的脂肪被充分氧化供能了。

腸道是魚類吸收和利用營養(yǎng)物質(zhì)的重要場所，腸道結(jié)構(gòu)的完整性影響魚類的生長發(fā)育[54]。研究表明，富含DF的豆粕型飼糧會引起非感染性腸炎[55]，主要表現(xiàn)為腸道絨毛褶皺高度下降、固有層和黏膜下層的寬度增加、白細(xì)胞浸潤[56]。高DF飼糧也會引起腸道組織損傷[13,24]，然而本研究中2組魚均未出現(xiàn)明顯的組織病理改變(圖3)，這可能與養(yǎng)殖后期試驗魚攝食率下降有關(guān)。有研究表明，腸組織自我修復(fù)能力較強(qiáng)[57-58]，停飼后較短時間內(nèi)即可恢復(fù)正常[59]。盡管如此，HL組后腸組織中炎性反應(yīng)相關(guān)基因NF-κβ、TNFα、IL-10和TGFβmRNA相對表達(dá)量均顯著低于LL組，提示HL組罹患腸炎的風(fēng)險較低。

4 結(jié) 論

在DF含量較高的飼糧中，提高脂肪水平并未引起肝臟脂肪含量增加，卻可改善大口黑鱸幼魚生長性能，緩解氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，降低肝臟和腸道組織損傷的風(fēng)險。