金建麗， 李偉航，2， 陸 灝， 劉泓瑋

(1.牡丹江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 黑龍江 牡丹江 157011； 2.牡丹江市衛(wèi)生學(xué)校， 黑龍江 牡丹江 157011)

擬赤梢魚(Pseudaspiusleptocephalus)屬脊索動物門、輻鰭魚綱、鯉形目、鯉科、擬赤梢魚屬，是擬赤梢魚屬在我國僅有的一種魚，在黑龍江中游分布最廣[1]。因其脂肪少，肉質(zhì)細(xì)膩，味道鮮美而深受消費(fèi)者喜愛，為當(dāng)?shù)刂匾慕?jīng)濟(jì)魚類[2]。目前，對擬赤梢魚已有部分研究報(bào)道[3-6]，但對其消化系統(tǒng)中消化酶和免疫酶的研究未見報(bào)道。蛋白酶(PRO)、淀粉酶(AMS)、酯酶(EST)是生物體內(nèi)3種重要的消化酶，是由消化道或消化腺分泌并起營養(yǎng)消化作用的一種特殊酶類。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)是生物體內(nèi)重要的免疫酶，其中，SOD是抗氧化系統(tǒng)的重要成員之一，不僅能清除體內(nèi)多余的自由基，降解溶酶體內(nèi)的細(xì)菌及異物，并在免疫中發(fā)揮重要作用；POD是存在于各種動物、植物和微生物體內(nèi)的一類氧化酶，催化由過氧化氫參與的各種還原劑的氧化反應(yīng)，從而對細(xì)胞起保護(hù)作用[7]。筆者采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)方法對以上5種酶在擬赤梢魚消化系統(tǒng)中的分布與活性進(jìn)行研究，以期為擬赤梢魚的基礎(chǔ)生物學(xué)、消化生理特征研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 擬赤梢魚 于2015年5月在牡丹江市鏡泊湖捕獲，共30條，雌、雄各15條，均為健康成體，體重(217.81±53.50)g，體長(24.88±1.49)cm。

1.1.2 儀器 高速冷凍離心機(jī)(Beck-man Coultertm AllegraTM 64R Centrifuge)，微量移液槍(Rainin Pipetlite Magnetic Assist Pipette SL-100、SL-1000，德國Eppendorf公司)，凝膠成像系統(tǒng)(MultilmageTM Light Cabinet Alpla Innotech Corporation，美國Alpha公司)，三恒多用電泳儀(ECP3000，北京六一儀器廠)。

1.1.3 藥品 Tris、四甲基乙二胺(TEMED)、可溶性淀粉、丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甲叉雙丙酰胺、瓊脂糖、甘氨酸、溴酚藍(lán)、醋酸鈉、碘、丙三醇、冰乙酸、PMS、過硫酸銨、固藍(lán)RR鹽、碘化鉀、α-醋酸萘酯、β-醋酸萘酯、NBT、CBR-250、聯(lián)苯胺等，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

采用PAGE方法對擬赤梢魚消化系統(tǒng)的消化酶(PRO、AMS、EST)和免疫酶(SOD、POD)進(jìn)行分離分析，并根據(jù)電泳圖譜繪制出譜帶分布和電泳遷移率表[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRO分布與活性

從圖1、表1可知，PRO在擬赤梢魚消化系統(tǒng)中共分離出遷移率為0.006～0.712的17條譜帶(PRO1～PRO17)。食道分離出PRO1～PRO11、PRO13、PRO15～PRO17共15條譜帶。前腸分離出PRO2～PRO11、PRO13、PRO15～PRO17共14條譜帶。中腸分離出PRO3～PRO11、PRO13、PRO14、PRO16、PRO17共13條譜帶。后腸分離出PRO3、PRO4、PRO6、PRO7、PRO9～PRO13、PRO15～PRO17共12條譜帶。肝胰臟共有2條譜帶，分別為PRO13和PRO15。PRO1為食道特有譜帶，PRO14為中腸特有譜帶，PRO12為后腸特有譜帶。其中，PRO13為食道、前腸、中腸、后腸和肝胰臟共有譜帶，電泳遷移率為0.111。擬赤梢魚食道內(nèi)PRO活性最高且譜帶數(shù)目最多；腸道內(nèi)PRO活性最高的為前腸，明顯高于中腸和后腸，肝胰臟內(nèi)PRO活性最低。5種組織中PRO活性依次為食道>前腸>中腸>后腸>肝胰臟。

圖1 擬赤梢魚消化系統(tǒng)PRO電泳圖譜

Fig.1 Electrophoresis pattern of PRO in digestive system ofP.leptocephalus

2.2 AMS分布與活性

從圖2、表2可知，AMS在擬赤梢魚消化系統(tǒng)中共分離出遷移率為0.197～0.386的5條譜帶(AMS1～AMS5)。在食道、前腸、中腸、后腸和肝胰臟中均分離出5條譜帶，但各譜帶的活性強(qiáng)弱不同，AMS5的活性最強(qiáng)，為主帶，在中腸表現(xiàn)最強(qiáng)、前腸表現(xiàn)最弱。AMS3活性在中腸、后腸和肝胰臟均表現(xiàn)最弱。5種組織中，中腸和后腸的酶譜最為相似，除AMS3和AMS4，其余譜帶的活性一致。5種組織中AMS的活性依次為后腸>中腸>前腸>食道>肝胰臟。

圖2 擬赤梢魚消化系統(tǒng)AMS電泳圖譜

Fig.2 Electrophoresis pattern of AMS in digestive system ofP.leptocephalus

2.3 EST分布與活性

由圖3、表3可知，EST在消化系統(tǒng)中共分離出遷移率為0.064～0.868的19條譜帶(EST1～EST19)。EST在擬赤梢魚消化系統(tǒng)的各組織中均有表達(dá)，食道中分離出EST2～EST8、EST12、EST13、EST15、EST16共11條譜帶。前腸、中腸和后腸均分離出EST3～EST8、EST10～EST16共13條譜逞。肝胰臟中分離出EST1、EST2、EST4、EST6、EST7、EST9、EST12、EST15～EST19共12條譜帶。EST15、EST16為5種組織共有譜帶，EST10、EST11、EST14為腸道特有譜帶，EST1、EST9、EST17、EST18、EST19為肝胰臟特有譜帶。5種組織共有譜帶中EST15、EST16的活性最強(qiáng)，為主帶。5種組織中EST的活性依次為肝胰臟>前腸>中腸>食道>后腸。

圖3 擬赤梢魚消化系統(tǒng)EST電泳圖譜

Fig.3 Electrophoresis pattern of EST in digestive system ofP.leptocephalus

2.4 SOD分布與活性

由圖4、表4可知，SOD在消化系統(tǒng)中共分離出遷移率為0.088～0.716的11條譜帶(SOD1～SOD11)。食道中分離出SOD1～SOD7、SOD10、SOD11共9條譜帶。前腸中分離出SOD1～SOD7、SOD9、SOD11共9條譜帶。中腸和后腸中均分離出SOD1～SOD4、SOD6、SOD7、SOD9、SOD11共8條譜帶。肝胰臟中分離出SOD1～SOD4，SOD7～SOD9，SOD11共8條譜帶。SOD1～SOD4、SOD7、SOD11為5種組織中共有譜帶，其中SOD3、SOD4的活性最強(qiáng)，為主帶。SOD10為食道特有譜帶，SOD8為肝胰臟特有譜帶。5種組織中SOD活性依次為前腸>中腸>食道>肝胰臟>后腸。

圖4 擬赤梢魚消化系統(tǒng)SOD電泳圖譜

Fig.4 Electrophoresis pattern of SOD in digestive system ofP.leptocephalus

2.5 POD分布與活性

由圖5、表5可知，POD在消化系統(tǒng)中共分離出遷移率為0.070～0.753的13條譜帶(POD1～POD13)。前腸和后腸中均分離出POD3、POD5～POD7、POD9、POD11、POD12共7條譜帶。中腸中分離出POD3、POD5～POD7、POD9、POD11～POD13共8條譜帶。肝胰臟中分離出POD4～POD7、POD9～POD13共9條譜帶。POD5～POD7、POD9、POD11、POD12為消化系統(tǒng)5種組織共有譜帶。POD1、POD2、POD8為前腸特有譜帶，POD4為肝胰臟特有譜帶。5種組織中POD活性依次為肝胰臟>后腸>中腸>食道>前腸。

圖5 擬赤梢魚消化系統(tǒng) POD電泳圖譜

Fig.5 Electrophoresis pattern of POD in digestive system ofP.leptocephalus

3 討論

3.1 擬赤梢魚消化酶電泳譜帶分布與活性

PRO是參與生物體內(nèi)多種生物過程的重要水解酶，幾乎所有脊椎動物消化道都含有類似的蛋白酶。擬赤梢魚為無胃魚類，消化道是消化蛋白質(zhì)的主要部位。其消化系統(tǒng)蛋白酶活性以食道最高。腸道內(nèi)以前腸中蛋白酶活性最高，明顯高于中腸與后腸，呈逐漸遞減趨勢，與對鱖魚等[9]的研究結(jié)果一致。擬赤梢魚肝胰臟內(nèi)蛋白酶活性明顯低于腸道與食道，且活性較低，與李效宇等[10]對金魚，白曉慧[11]對黑尾近紅鲌的研究結(jié)果一致。

AMS是一種能夠水解淀粉的重要酶類，廣泛存在于動植物及微生物體內(nèi)，功能都是分解淀粉。擬赤梢魚消化系統(tǒng)淀粉酶活性以后腸最高，且明顯高于其余組織。消化道的淀粉酶活性顯著高于肝胰臟，與對鱖魚等[9]的研究結(jié)果一致。擬赤梢魚的淀粉消化主要是在腸道內(nèi)進(jìn)行，與胡思玉等[12]對昆明裂腹魚的研究結(jié)果相符。

擬赤梢魚消化系統(tǒng)的EST在肝胰臟中活性最強(qiáng)，且明顯高于其余組織，譜帶表達(dá)具有明顯的組織特異性。肝臟除作為參與消化的腺體外，還是機(jī)體內(nèi)最大的清除毒物的器官，活躍的脂類代謝使EST在肝臟中呈高強(qiáng)度表達(dá)，EST在各組織中的表達(dá)強(qiáng)弱與其生理功能相適應(yīng)。

3.2 擬赤梢魚免疫酶電泳譜帶分布與活性

SOD是需氧生物抗氧化系統(tǒng)的一種重要酶類，消化道中SOD對隨食物進(jìn)入體內(nèi)的細(xì)菌引起的歧化反應(yīng)發(fā)揮重要作用，對提高機(jī)體的非特異性免疫具有重要意義[13]。SOD在擬赤梢魚消化系統(tǒng)5種組織中均有表達(dá)，且都表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性。SOD10為食道特有譜帶，SOD8為肝胰臟特有譜帶；同時(shí)，食道和肝胰臟都有譜帶缺失現(xiàn)象。

POD是一類能利用H2O2氧化供氫體的氧化酶，廣泛存在于動植物各種組織中，能清除氨基酸分解代謝以及糖醛酸合成代謝等過程中形成的過氧化物[14]。擬赤梢魚消化系統(tǒng)5種組織中POD活性表現(xiàn)出明顯的組織特異性。肝胰臟血流豐富、白細(xì)胞及吞噬細(xì)胞含量較多，其POD的活性最強(qiáng)，且明顯高于其余4種組織，說明POD表達(dá)與組織的功能一致。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，擬赤梢魚消化系統(tǒng)5種組織中PRO活性依次為食道>前腸>中腸>后腸>肝胰臟；AMS活性依次為后腸>中腸>前腸>食道>肝胰臟；EST活性依次為肝胰臟>前腸>中腸>食道>后腸。SOD活性依次為前腸>中腸>食道>肝胰臟>后腸；POD活性依次為肝胰臟>后腸>中腸>食道>前腸；各種酶在消化系統(tǒng)中分布及活性均表現(xiàn)出明顯的組織特異性，酶的表達(dá)強(qiáng)度與所執(zhí)行的功能相關(guān)。