張 林 夏海斌 徐 潔 曾涵芳 韓兆玉*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院乳?？茖W(xué)研究所，南京210095；2.北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司，北京100081)

在反芻動(dòng)物瘤胃中存在著大量的微生物，包括細(xì)菌、真菌、原蟲和古菌等。瘤胃內(nèi)微生物區(qū)系與宿主的營(yíng)養(yǎng)、代謝和免疫密切相關(guān)[1]。在微生物作用下，碳水化合物被發(fā)酵成為揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，如乙酸、丙酸和丁酸等，這些是主要的產(chǎn)能物質(zhì)，占總能量的70%～80%。非纖維性碳水化合物(non-fiber carbohydrate，NFC)是反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的重要組成部分，在瘤胃內(nèi)可被微生物快速降解。在飼糧中添加NFC(如淀粉)可促進(jìn)微生物蛋白(MCP)的合成[2]，增強(qiáng)乳腺攝取游離氨基酸的能力[3-4]，改善乳腺中氨基酸的利用，促進(jìn)乳蛋白合成[5]。中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)主要包括半纖維素、纖維素和木質(zhì)素，常被用作纖維性碳水化合物的指標(biāo)。雖然上述成分不容易被單胃動(dòng)物消化利用，但可以被瘤胃微生物發(fā)酵代謝，同時(shí)還能促進(jìn)反芻動(dòng)物的咀嚼和胃腸蠕動(dòng)，有利于保持其健康狀態(tài)[6]。因此，二者在奶牛飼糧中均不可或缺，都為奶牛的健康生產(chǎn)提供了保障。

Nocek等[7]提出NFC和NDF之間存在交互作用，并認(rèn)為奶牛飼糧中理想的NFC/NDF水平為0.9～1.2。而隨著全球范圍內(nèi)奶牛產(chǎn)奶量的普遍提高，飼糧中NFC含量也隨之增長(zhǎng)，以滿足奶牛泌乳等方面營(yíng)養(yǎng)需求。有研究報(bào)道，提高飼糧NFC/NDF水平有助于奶牛生產(chǎn)性能的提高[8-9]；但是過(guò)高的精料往往導(dǎo)致乳酸菌和革蘭氏陰性菌異常生長(zhǎng)和死亡，使得乳酸和脂多糖大量產(chǎn)生，對(duì)動(dòng)物的健康和泌乳性能產(chǎn)生負(fù)面作用[10]。因此，有必要進(jìn)一步研究飼糧NFC/NDF水平對(duì)奶牛的影響，探究飼糧營(yíng)養(yǎng)成分與瘤胃微生物之間的相互作用，增強(qiáng)人們對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵代謝特點(diǎn)的認(rèn)識(shí)與了解。

鑒于此，本試驗(yàn)旨在研究不同飼糧NFC/NDF水平下瘤胃發(fā)酵和微生物組成的動(dòng)態(tài)變化，選取3頭健康的中國(guó)荷斯坦奶牛采集瘤胃液，以3種NFC/NDF水平全混合日糧(TMR)作為發(fā)酵底物，建立體外發(fā)酵體系，探究飼糧碳水化合物在發(fā)酵代謝過(guò)程中與瘤胃微生物之間的互作關(guān)系，為奶牛飼糧合理配制提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 發(fā)酵底物

NFC/NDF水平分別為1.38(飼糧A)、1.19(飼糧B)和1.08(飼糧C)的3種飼糧(其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1)，于烘箱內(nèi)65 ℃烘干(48 h)，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎10 s，過(guò)20目篩。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.1.2 瘤胃液

選取3頭健康奶牛[體重(605±35) kg]，屠宰后迅速于瘤胃上、下、左、右不同點(diǎn)位釆集足夠量的瘤胃液(合計(jì)1 L)，用4層紗布過(guò)濾后，灌入充滿二氧化碳(CO2)并經(jīng)過(guò)預(yù)熱的保溫瓶中(約39 ℃)，灌滿后瓶口封嚴(yán)，立刻帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基的配制參照Theodorou等[11]描述的方法，制備完成后，與瘤胃液按1∶2比例均勻混合，用于體外發(fā)酵試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)根據(jù)發(fā)酵底物分為3個(gè)組(A組、B組和C組)，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)有4個(gè)發(fā)酵瓶。發(fā)酵瓶(170 mL)中按組別稱量發(fā)酵底物1 g，然后用分裝儀加入100 mL混合培養(yǎng)液(持續(xù)充入CO2保持厭氧環(huán)境)。分裝完畢后，用橡膠塞和鋁蓋將發(fā)酵瓶密封并放入氣浴搖床中，在39 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h。

1.3 樣本采集與發(fā)酵參數(shù)測(cè)定

培養(yǎng)期間分別在2、4、6、12、18、24、36和48 h時(shí)測(cè)定發(fā)酵瓶的氣壓，根據(jù)氣壓體積公式計(jì)算相對(duì)應(yīng)的產(chǎn)氣量(GP)[12]。計(jì)算公式為：

GP(mL)=0.18+3.697×Pt+0.082 4×Pt2。

式中：Pt為檢測(cè)到的氣壓值。

分別在6、12、24和48 h時(shí)，從每組4個(gè)重復(fù)中分別取出1個(gè)發(fā)酵瓶(共12個(gè))，立即置于冰水中終止發(fā)酵。取出發(fā)酵液測(cè)定pH，并將樣品分裝凍存在-20 ℃，用于測(cè)定VFA、乳酸、氨態(tài)氮(NH3-N)和MCP含量；用于瘤胃細(xì)菌16S rRNA基因測(cè)序分析的樣品則置于液氮中保存。發(fā)酵液中VFA含量采用GC-14B型氣相色譜儀(日本島津)進(jìn)行測(cè)定，方法參照秦為琳[13]的氣相色譜法；發(fā)酵液中乳酸含量采用比色法測(cè)定，試劑盒來(lái)自南京建成生物工程研究所；發(fā)酵液中NH3-N含量參照Searle[14]的方法進(jìn)行測(cè)定；發(fā)酵液中MCP含量根據(jù)Makkar等[15]描述的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4 微生物DNA提取與16S rRNA基因測(cè)序

微生物總DNA采用Tiangen DNA試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]進(jìn)行提取，采用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法檢測(cè)基因組DNA的濃度和純度。16S rRNA基因測(cè)序以V3～V4為目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物信息[16]見(jiàn)表2。第1輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)之后，使用AMPure XP Beads對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，再進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增完成的PCR產(chǎn)物純化和質(zhì)檢之后，構(gòu)建MiSeq文庫(kù)并進(jìn)行測(cè)序。MiSeq測(cè)序完成后，利用overlap將雙端數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，并進(jìn)行質(zhì)控、嵌合體過(guò)濾，獲得高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)，并對(duì)最終獲得有效數(shù)據(jù)進(jìn)行97%的相似度聚類，獲得最終的操作分類單元(OTU)豐度及代表序列，進(jìn)一步進(jìn)行物種分類注釋和差異分析。試驗(yàn)使用RDP和NT-16S數(shù)據(jù)庫(kù)資源做物種分類及差異分析，以保證注釋結(jié)果完整準(zhǔn)確，并使用R軟件對(duì)發(fā)酵參數(shù)和微生物區(qū)系進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。

表2 微生物引物信息

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 20.0軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。基于一般線性模型(generalized linear model,GLM)評(píng)估比較平均值，采用最小顯著差(least significant difference,LSD)法進(jìn)行組間多重比較。P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧NFC/NDF水平對(duì)奶牛瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響

由表3可知，2 h時(shí)，A組和B組GP顯著高于C組(P<0.05)；4、6和12 h時(shí)，A組GP顯著高于B組和C組(P<0.05)。此外，GP隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)極顯著升高(P<0.01)，且飼糧和發(fā)酵時(shí)間對(duì)GP有極顯著交互作用(P<0.01)。

由表4可知，12 h時(shí)，A組和B組pH顯著低于C組(P<0.05)；24 h時(shí)，A組pH顯著高于B組和C組(P<0.05)。6和24 h時(shí)，A組MCP含量顯著高于B組和C組(P<0.05)；48 h時(shí)，A組MCP含量顯著低于B組和C組(P<0.05)。6 h時(shí)，A組和B組NH3-N含量顯著高于C組(P<0.05)。此外，3組pH隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)均先降低后升高，且均在12 h時(shí)達(dá)到最低；乳酸含量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)先升高再降低，在12 h時(shí)達(dá)到最高；NH3-N和MCP含量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)均逐漸升高，在48 h時(shí)二者含量顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)。

表3 飼糧NFC/NDF水平對(duì)奶牛瘤胃體外發(fā)酵GP的影響

表4 飼糧NFC/NDF水平對(duì)奶牛瘤胃體外發(fā)酵特性的影響

4Items GroupsABCSEMP P-valueDietTime×Diet×time Lactate/(mg/dL)6 h6.45B5.44B5.94B0.570.49612 h16.56A16.19A16.02A0.810.895<0.0010.94524 h0.41C0.38C0.35C0.020.09348 h0.44C0.48C0.34C0.040.130

由表5可知，12 h時(shí)，B組乙酸/丙酸值顯著高于C組(P<0.05)；24 h時(shí)，A組總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)含量顯著低于C組(P<0.05)，A組乙酸含量顯著低于B組和C組(P<0.05)，而A組和B組戊酸含量低于C組(P<0.05)；48 h時(shí)，A組TVFA和異戊酸含量顯著高于C組(P<0.05)，A組和B組乙酸含量顯著高于C組(P<0.05)，A組丙酸含量顯著高于B組(P<0.05)，A組和C組乙酸/丙酸值顯著低于B組(P<0.05)。此外，A組TVFA和乙酸含量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，而B(niǎo)組和C組TVFA和乙酸含量均先升高再降低；3組丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸含量均隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，而乙酸/丙酸值均先升高再降低。飼糧和發(fā)酵時(shí)間對(duì)TVFA(P<0.01)、乙酸(P<0.01)、丙酸(P<0.01)、戊酸(P<0.01)、異戊酸(P<0.01)含量和乙酸/丙酸值(P<0.05)有顯著或極顯著交互作用。

表5 飼糧NFC/NDF水平對(duì)奶牛瘤胃體外發(fā)酵VFA組成的影響

5Items GroupsABCSEMP P-valueDietTime×Diet×time Isobutyrate/(mmol/L)6 h0.24B0.23C0.25B0.010.51412 h0.38AB0.29BC0.36B0.060.591<0.0010.07924 h0.30B0.30B0.30B0.010.92548 h0.83A0.53A0.50A0.110.134 Isovalerate/(mmol/L)6 h0.42C0.39C0.44C0.020.25012 h0.39C0.43C0.41C0.020.582<0.0010.00424 h0.80B0.73B0.78B0.030.23148 h1.33Aa1.15Ab1.13Ab0.040.022 Valerate/(mmol/L)6 h0.35C0.27B0.24B0.040.24012 h0.57C0.35B0.49B0.080.189<0.0010.00524 h3.42Bb3.77Ab4.16Aa0.080.00248 h4.17A3.92A3.95A0.180.614/ Acetate/propionate6 h5.14B5.15B4.99B0.060.18412 h6.19Aab6.34Aa5.85Ab0.100.036<0.0010.01924 h2.17C2.29C2.28C0.040.11448 h2.01Cb2.23Ca1.97Db0.050.018

2.2 飼糧NFC/NDF水平對(duì)奶牛瘤胃體外發(fā)酵微生物區(qū)系的影響

由圖1和表6可知，在門水平上共鑒別出19種細(xì)菌，其中相對(duì)豐度超過(guò)1%的核心細(xì)菌有5種，平均相對(duì)豐度由高到低分別為為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、黏膠球形菌門和螺旋體門。在門水平上，細(xì)菌相對(duì)豐度受發(fā)酵時(shí)間極顯著影響(P<0.01)，但相對(duì)豐度超過(guò)1%的菌群種類未發(fā)生改變；擬桿菌門、變形菌門和黏膠球菌門的相對(duì)豐度隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，厚壁菌門的相對(duì)豐度隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高。此外，3組之間菌群在門水平上的相對(duì)豐度均無(wú)顯著差異(P>0.05)，這表明飼糧類型對(duì)門水平的菌群相對(duì)豐度無(wú)顯著影響。

由圖2和表7可知，在屬水平上，菌群相對(duì)豐度隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而極顯著變化(P<0.01)，部分細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)地位發(fā)生改變。其中，未分類的RF16和未分類的克里斯滕森菌科在12 h后相對(duì)豐度降到1%以下，而Oribacterium和巨球形菌屬?gòu)牡陀?%逐漸增加到10%以上，小桿菌屬、丁酸弧菌屬、厭氧弧菌屬和新月形單胞菌屬?gòu)牡陀?%逐漸增加到1%以上。此外，部分菌群相對(duì)豐度在發(fā)酵過(guò)程中受飼糧類型影響，其中普雷沃氏菌屬和丁酸弧菌屬受飼糧類型和發(fā)酵時(shí)間的交互作用(P<0.05)。6 h時(shí)，B組小桿菌屬相對(duì)豐度顯著高于A組和C組(P<0.05)；12 h時(shí)，C組普雷沃氏菌屬相對(duì)豐度顯著低于A組和B組(P<0.05)，A組厭氧弧菌屬相對(duì)豐度顯著高于B組(P<0.05)，C組小桿菌屬相對(duì)豐度顯著高于A組和B組(P<0.05)；24 h時(shí)，C組未分類的擬桿菌門相對(duì)豐度顯著低于A組和B組(P<0.05)；48 h時(shí)，B組未分類的γ-變形菌綱相對(duì)豐度顯著高于A組和C組(P<0.05)。

2.3 瘤胃微生物和發(fā)酵參數(shù)的相關(guān)性分析

對(duì)有顯著差異的發(fā)酵參數(shù)和屬水平細(xì)菌(相對(duì)豐度超過(guò)1%至少出現(xiàn)1次)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果如圖3所示。︱r︱大于0.9的結(jié)果如下：與GP呈正相關(guān)的有Oribacterium(r=0.901 9，P<0.01)，呈負(fù)相關(guān)的有未分類的擬桿菌門(r=-0.911 7，P<0.01)、未分類的BS11腸道群(r=-0.965 4，P<0.01)、未分類的RF16(r=-0.961 4，P<0.01)和解琥珀酸菌屬(r=-0.951 7，P<0.01)等；與MCP呈正相關(guān)的有Oribacterium(r=0.954 3，P<0.01)；與NH3-N呈負(fù)相關(guān)的有未分類的γ-變形菌綱(r=-0.912 9，P<0.01)；與TVFA呈正相關(guān)的有巨球形菌屬(r=0.900 5，P<0.01)，呈負(fù)相關(guān)的有未分類的擬桿菌門(r=-0.946 4，P<0.01)、未分類的BS11腸道群(r=-0.948 4，P<0.01)和解琥珀酸菌屬(r=-0.968 5，P<0.01)等；與乙酸呈負(fù)相關(guān)的有未分類的擬桿菌門(r=-0.942 0，P<0.01)、未分類的瘤胃球菌科(r=-0.907 5，P<0.01)和未分類的BS11腸道群(r=-0.968 3，P<0.01)等；丙酸與巨球形菌屬呈正相關(guān)(r=0.921 5，P<0.01)，而乙酸/丙酸值與巨球形菌屬呈負(fù)相關(guān)(r=-0.901 6，P<0.01)；此外，乳酸與未分類的毛螺菌科(r=-0.783 0，P<0.01)和巨球型菌屬(r=-0.776 0，P<0.01)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果表明，部分已知的瘤胃微生物如解琥珀酸菌屬與GP、TVFA、乙酸、丙酸和丁酸呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；Oribacterium與GP和MCP呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；巨球形菌屬與TVFA、丙酸和丁酸呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與乙酸/丙酸值和乳酸呈顯著負(fù)相關(guān) (P<0.05)。同時(shí)，還有大量未分類細(xì)菌也與瘤胃發(fā)酵關(guān)系密切，需要進(jìn)一步分析。

圖1 細(xì)菌門水平相對(duì)豐度熱圖

表6 細(xì)菌門水平相對(duì)豐度

6Items GroupsABCSEMP P-valueDietTime×Diet×time Proteobacteria6 h17.12A17.04A17.00B0.3770.97412 h17.90A18.81A19.15A0.5440.314<0.0010.70924 h13.29B12.90B13.47C0.3730.57248 h12.66B13.72B13.02C0.8230.671 Lentisphaerae6 h5.78A6.10A5.03A0.7090.57912 h2.29B2.76B2.90AB0.3790.526<0.0010.73124 h1.76B1.85B1.56B0.0830.11048 h1.63B1.86B1.62B0.1220.344 Spirochaetes6 h1.65A1.87A1.87A0.2880.74612 h1.02B1.16B1.06BC0.1320.753<0.0010.82224 h0.93B0.98B0.88C0.0330.19848 h1.88A1.70A1.79AB0.1080.521

圖2 細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度熱圖

3 討 論

3.1 飼糧NFC/NDF水平對(duì)奶牛瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響

GP是反映瘤胃發(fā)酵程度的綜合指標(biāo)，與瘤胃細(xì)菌活性呈正相關(guān)[17]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12 h之前，高NFC/NDF水平飼糧組(A組)GP顯著高于低NFC/NDF水平飼糧組(C組)，這可能與高NFC/NDF水平飼糧快速產(chǎn)生了大量VFA有關(guān)。Rodriguez等[18]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧碳水化合物在瘤胃中發(fā)酵產(chǎn)生大量氣體，主要包括氫氣(H2)、CO2和甲烷(CH4)。當(dāng)瘤胃pH小于6.2時(shí)，纖維素分解菌的生長(zhǎng)和繁殖會(huì)受到抑制，此時(shí)有利于高淀粉、高可溶性糖等NFC發(fā)酵分解。因此，瘤胃液pH的動(dòng)態(tài)變化間接反映瘤胃發(fā)酵過(guò)程，有助于人們對(duì)瘤胃消化代謝的了解。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，奶牛瘤胃體外發(fā)酵pH隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，降到一定水平后會(huì)恢復(fù)到較高的水平，但pH始終維持在6.4～6.8的正常水平，這與前人的研究結(jié)果[19]基本一致。pH的降低主要與VFA和乳酸的產(chǎn)生有關(guān)，但較低pH會(huì)刺激瘤胃上皮細(xì)胞對(duì)VFA的吸收。Nocek等[20]認(rèn)為pH的先降后升可能與飼糧發(fā)酵速率的降低、乳酸和VFA的吸收利用以及瘤胃自身強(qiáng)大的緩沖能力有關(guān)。本試驗(yàn)中，12和24 h時(shí)的發(fā)酵液pH受飼糧NFC/NDF水平的顯著影響。12 h時(shí)，高NFC/NDF水平飼糧組的pH顯著低于低NFC/NDF水平飼糧組；而24 h時(shí)，高NFC/NDF水平飼糧組的pH顯著高于低NFC/NDF水平飼糧組。這些結(jié)果可能與飼糧碳水化合物結(jié)構(gòu)特性有關(guān)，高NFC/NDF水平飼糧組中易發(fā)酵的碳水化合物較多，發(fā)酵速率快，而這些碳水化合物的發(fā)酵產(chǎn)物為乳酸和VFA，造成pH降低；而低NFC/NDF水平飼糧組的pH變化則相對(duì)緩慢。

表7 細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度

7Items GroupsABCSEMP P-valueDietTime×Diet×time48 h0.77C0.80B0.73C0.0860.840 Unclassified Bacteroidetes6 h2.81A2.75A2.53A0.1350.37812 h2.12B2.03B2.18A0.0760.429<0.0010.11324 h1.16Ca1.26Ca0.88Cb0.0630.01248 h1.50C1.42C1.47B0.0760.735 Streptococcus6 h3.39B3.32B3.97B0.4080.50212 h8.23A7.46A7.92A0.8430.818<0.0010.59324 h4.68B5.33AB6.19AB0.3470.05848 h4.58B5.16AB1.27C0.1920.176 Succiniclasticum6 h3.36A3.05A3.50A0.2100.36012 h2.69B2.63B2.69B0.0520.638<0.0010.61624 h1.23C1.10C1.35C0.0590.06648 h1.26C1.25C4.96B0.0700.979 Megasphaera6 h0.29C0.22C0.25C0.0310.32612 h0.07C0.05C0.05C0.0120.706<0.0010.09424 h13.80A15.09A11.89A1.1620.22648 h8.29B8.54B9.20B0.4490.395Oribacterium6 h0.18D0.21C0.15D0.0180.12312 h3.32C3.83B3.05C0.2350.136<0.0010.09524 h5.33B4.70B6.09B0.4820.20748 h10.70A10.57A11.34A0.3920.387 Butyrivibrio6 h0.52B0.50B0.46B0.0470.69712 h0.48B0.39B0.51B0.0280.060<0.0010.00624 h0.36B0.35B0.51B0.0430.06548 h1.70A1.42A1.25A0.1120.076 Anaerovibrio6 h0.38C0.39C0.39C0.0440.99412 h0.60Ba0.48Cb0.52BCab0.0260.048<0.0010.27624 h0.75B0.87B0.81B0.0770.58248 h2.02A2.18A1.94A0.0930.253 Dialister6 h0.05Cb0.07Ba0.05Cb0.002<0.00112 h0.05Cb0.09Bb0.24Ca0.0370.025<0.0010.57524 h1.39B1.68A1.43B0.0950.14448 h2.03A2.22A2.07A0.1830.745 Selenomonas6 h0.20C0.18C0.21C0.0180.63612 h0.29C0.27C0.27C0.0300.920<0.0010.578

7Items GroupsABCSEMP P-valueDietTime×Diet×time24 h0.64B0.65B0.64B0.0370.99448 h1.21A1.06A1.12A0.0620.307 Unclassified Lachnospiraceae6 h2.05C2.08BC2.06B0.0810.95812 h1.80C1.76C1.62C0.0610.171<0.0010.31524 h2.46B2.42B2.32B0.0770.45148 h3.18A2.95A3.20A0.1150.294 Unclassified Ruminococcaceae6 h3.18A3.42A3.15A0.1040.21112 h1.92B2.03B2.09B0.1030.532<0.0010.29624 h1.70B1.56C1.53C0.1040.50848 h2.13B2.12B2.03B0.0490.344 Unclassified Christensenellaceae6 h1.30A1.69A1.38A0.1770.32212 h1.02AB1.00B1.01AB0.0760.988<0.0010.31624 h0.74B0.72B0.72B0.0620.96848 h0.95AB0.82B0.87B0.0680.449 Unclassified Veillonellaceae6 h2.13A1.90A2.16A0.0940.17512 h1.92A1.85A1.90A0.0440.531<0.0010.32724 h1.43B1.36B1.50B0.0620.33148 h1.22B1.27B1.21B0.0620.779 Succinivibrio6 h2.50B2.32B2.38C0.1480.69112 h4.77A3.75B4.44AB0.3550.199<0.0010.22124 h3.33AB3.88AB3.37BC0.2280.24848 h4.70A5.49A5.17A0.5190.585γ- Unclassified Gammaproteobacteria6 h8.97A9.50A9.05A0.4800.71612 h5.83B6.38B5.83B0.4280.604<0.0010.99524 h2.57C2.95C2.76C0.0950.07848 h1.27Cb1.47Da1.28Db0.0460.037 Unclassified Lentisphaerae6 h4.64A4.85A3.97A0.5660.55512 h1.72B2.17B2.30AB0.3150.442<0.0010.64424 h1.29B1.37B1.13B0.0620.08648 h1.18B1.40B1.20B0.1070.315

基于發(fā)酵參數(shù)和屬相對(duì)豐度對(duì)應(yīng)的關(guān)系矩陣?yán)L制了頂部和左側(cè)的層次聚類，并根據(jù)發(fā)酵參數(shù)和屬相對(duì)豐度的Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行著色，紅色代表正相關(guān)，藍(lán)色代表負(fù)相關(guān)(*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001)。

VFA是瘤胃發(fā)酵的重要產(chǎn)物，也是微生物和宿主的重要能量來(lái)源。研究表明，VFA可為機(jī)體提供70%～80%的能量，其中乙酸、丙酸和丁酸約占TVFA的95%[25]。因此，乙酸、乙酸/丙酸值可以反映飼糧在瘤胃中的發(fā)酵類型。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸/丙酸值受飼糧NFC/NDF水平的顯著影響，同時(shí)受飼糧類型和發(fā)酵時(shí)間交互作用的影響。通常情況下，飼糧中過(guò)高NFC會(huì)造成瘤胃pH快速降低，當(dāng)pH低于6.2時(shí)，纖維素分解菌會(huì)受到抑制，此時(shí)的發(fā)酵類型以產(chǎn)丙酸為主。但在48 h過(guò)程中，pH一直維持在6.4～6.8，因此組間的發(fā)酵類型并沒(méi)有呈現(xiàn)規(guī)律性差異。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，12 h之后TVFA的含量顯著提高而乳酸含量顯著降低，可能是VFA的增加與乳酸的降低密切相關(guān)。此外，有研究表明，飼糧碳水化合物結(jié)構(gòu)并不影響TVFA的產(chǎn)量[26-27]，這與本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。

3.2 飼糧NFC/NDF水平對(duì)奶牛瘤胃體外發(fā)酵微生物區(qū)系的影響

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，24 h之前，擬桿菌門是最主要的菌群，其相對(duì)豐度但隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低；而厚壁菌門相對(duì)豐度逐漸升高，到48 h時(shí)超過(guò)了擬桿菌門，這可能與瘤胃pH有關(guān)。研究表明，低pH環(huán)境下革蘭氏陰性菌的豐度會(huì)降低[28-29]。此外，Hook等[30]也發(fā)現(xiàn)，瘤胃pH降低會(huì)引起瘤胃微生物中擬桿菌門的減少和厚壁菌門的增加。本試驗(yàn)結(jié)果還顯示，門水平優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度隨發(fā)酵時(shí)間顯著變化，但其種類未受飼糧和發(fā)酵時(shí)間的影響，這與Jami等[31]的研究結(jié)果基本一致。同時(shí)，屬水平上優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度會(huì)也隨發(fā)酵時(shí)間顯著變化，且部分菌群的優(yōu)勢(shì)地位發(fā)生改變，其中Oribacterium和巨球形菌屬隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增多成為主要菌群，這可能與細(xì)菌降解功能和飼糧的發(fā)酵程度有關(guān)。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Oribacterium與GP和MCP的產(chǎn)生有很大關(guān)聯(lián)，而巨球形菌屬則與VFA呈強(qiáng)正相關(guān)。

普雷沃氏菌屬屬于擬桿菌門，是瘤胃內(nèi)主要的淀粉降解菌，且能夠降解飼糧蛋白質(zhì)[32]。本試驗(yàn)中，普雷沃氏菌屬是瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌且相對(duì)豐度最高，且不受飼糧類型影響，這與多數(shù)研究結(jié)果[33-34]基本一致。本試驗(yàn)中，12 h時(shí)，高NFC/NDF水平飼糧組普雷沃氏菌屬相對(duì)豐度顯著高于低NFC/NDF水平飼糧組，同時(shí)相關(guān)性分析顯示普雷沃氏菌屬與pH呈負(fù)相關(guān)。新月形單胞菌屬屬于革蘭氏陰性厚壁菌，是一種淀粉降解菌，但不能發(fā)酵纖維素和果膠，其主要發(fā)酵產(chǎn)物是乙酸和丙酸，豐度隨發(fā)酵時(shí)間逐漸提高，這可能與飼糧發(fā)酵程度有關(guān)。解琥珀酸菌屬在瘤胃內(nèi)的數(shù)量較少，具有降解淀粉的功能[35]，產(chǎn)物主要是乙酸和琥珀酸。本試驗(yàn)相關(guān)性分析表明，解琥珀酸菌屬與GP、TVFA、乙酸、丙酸和丁酸呈負(fù)相關(guān)。巨型球菌屬是主要的乳酸利用菌，在高谷物飼糧瘤胃中主要對(duì)D型和L型乳酸進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)物主要為丙酸、丁酸、戊酸和CO2。此外，巨型球菌屬還可利用葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵和生長(zhǎng)，產(chǎn)物為甲酸和己酸。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，巨型球菌屬與丙酸和丁酸呈正相關(guān)，與乙酸/丙酸值呈負(fù)相關(guān)。丁酸弧菌屬可發(fā)酵淀粉、非纖維多糖以及單糖，主要產(chǎn)物是乙醇、乙酸、丁酸、甲酸和乳酸，還伴有CO2和H2的產(chǎn)生。相關(guān)性分析顯示，琥珀酸弧菌屬與乙酸、丙酸和丁酸密切相關(guān)，這與Iqbal等[36]的研究結(jié)果基本一致。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)一些沒(méi)有分類的細(xì)菌在瘤胃發(fā)酵中發(fā)揮著重要作用，需要進(jìn)一步挖掘研究。

4 結(jié) 論

飼糧NFC/NDF水平、發(fā)酵時(shí)間及其交互作用顯著影響奶牛瘤胃體外發(fā)酵GP、pH、MCP、NH3-N、丙酸含量和乙酸/丙酸值。在本試驗(yàn)飼糧NFC/NDF水平范圍內(nèi)(1.08～1.38)，高NFC水平飼糧會(huì)導(dǎo)致pH在發(fā)酵前期出現(xiàn)下降，但pH均在正常水平，未出現(xiàn)瘤胃酸中毒風(fēng)險(xiǎn)；結(jié)合本團(tuán)隊(duì)動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)研究結(jié)果[37]，推薦飼糧NFC/NDF水平為1.19時(shí)，效果較好。

此外，在發(fā)酵過(guò)程中，瘤胃微生物群的組成僅受發(fā)酵時(shí)間的顯著影響。在門水平上，優(yōu)勢(shì)菌群地位沒(méi)有發(fā)生改變；在屬水平上，部分優(yōu)勢(shì)菌群隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生顯著變化。相關(guān)分析表明，瘤胃發(fā)酵代謝產(chǎn)物與部分細(xì)菌存在顯著相關(guān)性。