王 爽 黃路生 張亞男 陳 偉 黃雪冰 夏偉光 李凱潮 王勝林 鄭春田
(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所,畜禽育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部華南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省動(dòng)物育種與營養(yǎng)公共實(shí)驗(yàn)室,廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州510640)
維生素E(vitamin E)是一種脂溶性維生素,是最主要的抗氧化劑之一,可以抑制脂肪酸的氧化,保護(hù)細(xì)胞免受自由基的傷害。飼糧中維生素E水平不足會(huì)影響家禽生長性能、產(chǎn)蛋率、免疫器官和生殖系統(tǒng)的發(fā)育[1-2]。飼糧中補(bǔ)充維生素E可提高家禽生產(chǎn)性能,并減輕家禽在不同應(yīng)激條件下的負(fù)面影響[3-7]。因此,商業(yè)家禽飼糧中的維生素E水平高于NRC(1994)的推薦水平(10 IU/kg)。目前,對于家禽維生素E的研究主要集中在肉雞、蛋雞及北京鴨等其他品種上[8-13],關(guān)于蛋種鴨飼糧糧維生素E的研究很少,維生素E對蛋種鴨產(chǎn)蛋性能及抗氧化性能的作用是否與其他動(dòng)物相同有待于進(jìn)一步研究。因此,本研究旨在探討飼糧維生素E添加水平對蛋種鴨產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)及抗氧化性能的影響,探討維生素E在蛋種鴨上的應(yīng)用,為科學(xué)合理配制蛋種鴨飼糧提供技術(shù)依據(jù)。
采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),選擇504只120日齡健康、采食正常的福建龍巖麻鴨蛋種鴨,隨機(jī)分為6個(gè)組,每組6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)14只鴨,單籠飼養(yǎng)。采用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧,其組成及營養(yǎng)水平見表1。各組飼糧維生素E添加水平分別為0(對照)、12.5、25.0、50.0、100.0和200.0 mg/kg,試驗(yàn)期24周。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))
1.2.1 產(chǎn)蛋性能
試驗(yàn)期間,自由采食,準(zhǔn)確記錄各重復(fù)試驗(yàn)鴨每日蛋重、產(chǎn)蛋數(shù)量、投料量及剩料量。計(jì)算產(chǎn)蛋率、日均蛋重、平均日采食量、日產(chǎn)蛋重及料蛋比,計(jì)算公式如下:
產(chǎn)蛋率=100×產(chǎn)蛋數(shù)/試驗(yàn)鴨數(shù);
日均蛋重=每欄蛋重/蛋個(gè)數(shù);
平均日采食量=(投料量-剩料量)/試驗(yàn)鴨數(shù);
日產(chǎn)蛋重=產(chǎn)蛋率×平均蛋重;
料蛋比=平均日采食量/日產(chǎn)蛋重。
1.2.2 蛋品質(zhì)指標(biāo)
試驗(yàn)第16周,每個(gè)重復(fù)采集4枚蛋,用于測定蛋形指數(shù)、蛋殼強(qiáng)度、哈氏單位、蛋白高度、蛋黃色澤度、蛋黃重及蛋殼重。蛋形指數(shù)使用數(shù)顯游標(biāo)卡尺(500-703-20 CD-P20S,日本三豐公司)量出其縱徑和橫徑進(jìn)行測算(蛋形指數(shù)=縱徑/橫徑),蛋殼強(qiáng)度使用強(qiáng)度儀(EFR-01,ORKA Food Technology公司,以色列)測定,哈氏單位、蛋白高度和蛋黃色澤度使用全自動(dòng)蛋品分析儀(EA-01,ORKA Food Technology公司,以色列)測定,測定在48 h內(nèi)完成。分離蛋黃稱重,蛋黃丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。蛋殼清洗后65 ℃烘干稱重。
1.2.3 血漿抗氧化指標(biāo)
試驗(yàn)進(jìn)行24周后,每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)抽取2只試驗(yàn)鴨,翅靜脈采血5 mL,4 ℃下3 000 r/min離心10 min制備血漿。測定血漿谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和MDA含量以及總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC),試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。
1.2.4 肝臟抗氧化指標(biāo)
試驗(yàn)鴨采血后放血致死。打開腹腔,剪取肝臟樣品,-80 ℃凍存。測定肝臟GSH-Px、SOD活性和MDA含量以及T-AOC,試劑盒由南京建成生物工程究所提供。
1.2.5 肝臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá)
根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中谷胱甘肽過氧化物酶-1(glutathione peroxidase-1,GPX-1)、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)序列,利用Primer 6.0和Oligo 7.0設(shè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表2。采用Trizol Reagent肝臟總RNA,采用Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒以O(shè)ligo dT為引物合成cDNA第一鏈,分別對肝臟中GPX-1、HO-1、Nrf2進(jìn)行qRT-PCR。PCR反應(yīng)在MXPro 3500熒光定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行,以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參,每個(gè)樣本重復(fù)3次,采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA相對表達(dá)量。
表2 引物序列
數(shù)據(jù)采用SAS 9.12統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,以重復(fù)為試驗(yàn)數(shù)據(jù)單元,差異顯著時(shí)采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。P<0.05為差異顯著。
如表3所示,飼糧維生素E添加水平對蛋種鴨平均蛋重?zé)o顯著影響(P>0.05),但對蛋種鴨產(chǎn)蛋率、日產(chǎn)蛋重及料蛋比有顯著影響(P<0.05)。飼糧維生素E添加水平為12.5 mg/kg時(shí),產(chǎn)蛋率和日產(chǎn)蛋重顯著高于對照組(P<0.05),料蛋比顯著低于對照組(P<0.05)。
如表4所示,飼糧維生素E添加水平對蛋種鴨蛋殼強(qiáng)度、蛋白高度、蛋黃色澤度、哈氏單位、蛋殼重及蛋黃重?zé)o顯著影響(P>0.05),但對蛋黃MDA含量有顯著影響(P<0.05)。飼糧維生素E添加水平為100.0和200.0 mg/kg時(shí),蛋黃MDA含量顯著低于對照組(P<0.05)。
表3 飼糧維生素E添加水平對蛋種鴨產(chǎn)蛋性能的影響
表4 飼糧維生素E添加水平對蛋種鴨蛋品質(zhì)的影響
如表5所示,飼糧維生素E添加水平對蛋種鴨血漿和肝臟GSH-Px、SOD活性和T-AOC無顯著影響(P>0.05),但對血漿和肝臟MDA含量有顯著影響(P<0.05)。飼糧維生素E添加水平為12.5、25.0、50.0、100.0和200.0 mg/kg時(shí),血漿和肝臟MDA含量顯著低于對照組(P<0.05);且隨著飼糧維生素E添加水平的升高,血漿和肝臟MDA含量逐漸降低。
表5 飼糧維生素E添加水平對蛋種鴨血漿和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響
如表6所示,飼糧維生素E添加水平對蛋種鴨肝臟GPX-1及HO-1 mRNA相對表達(dá)量無顯著影響(P>0.05),但對肝臟Nrf2 mRNA相對表達(dá)量有顯著影響(P<0.05)。飼糧維生素E添加水平為100.0和200.0 mg/kg時(shí),肝臟Nrf2 mRNA相對表達(dá)量顯著低于對照組(P<0.05);且隨著飼糧維生素E添加水平的升高,肝臟Nrf2 mRNA相對表達(dá)量逐漸降低。
表6 飼糧維生素E添加水平對蛋種鴨肝臟抗氧化相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的影響
本研究中,基礎(chǔ)飼糧中維生素E水平為15.50 mg/kg,飼糧中未添加維生素E的對照組產(chǎn)蛋率、日產(chǎn)蛋重及料蛋比均低于其他各組,表明基礎(chǔ)飼糧中維生素E水平不能滿足蛋種鴨的基本需要,補(bǔ)充維生素E可以提高蛋鴨的產(chǎn)蛋性能,但當(dāng)飼糧維生素E添加水平高于12.5 mg/kg時(shí),產(chǎn)蛋率、日產(chǎn)蛋重產(chǎn)蛋量和料蛋比并沒有進(jìn)一步提高,飼糧維生素E添加水平為12.5 mg/kg時(shí)獲得最好的產(chǎn)蛋性能。這與劉士杰等[14]對“京紅1號(hào)”蛋雞的研究結(jié)果一致,但高于NRC(1994)給出的蛋種鴨的推薦量。以往的研究結(jié)果與本試驗(yàn)不盡相同,鄧萍等[15]對攸縣麻鴨的研究發(fā)現(xiàn),飼糧添加50 IU/kg維生素E可以顯著提高其產(chǎn)蛋性能,但試驗(yàn)沒有進(jìn)行不同添加水平的比較。Schiavone等[16]研究發(fā)現(xiàn),番鴨飼糧中添加30和230 mg/kg α-生育酚乙酸酯對其生長性能沒有顯著影響。Xie等[2]研究也發(fā)現(xiàn),北京鴨飼糧中添加5和100 mg/kg α-生育酚乙酸酯對其生長性能方面沒有顯著的改善效果。在蛋雞的研究中發(fā)現(xiàn),如果基礎(chǔ)飼糧能夠滿足蛋雞對維生素E的基本需求,飼喂更高水平的維生素E飼糧均未對產(chǎn)蛋高峰期蛋雞產(chǎn)蛋率、蛋重、日產(chǎn)蛋重等指標(biāo)產(chǎn)生顯著的提高效果[11-12,17-18];但產(chǎn)蛋后期蛋雞對維生素E的需要為120 IU/kg,高于產(chǎn)蛋高峰期蛋雞[19]。這些研究表明,滿足動(dòng)物基本維生素E需求后,維生素E的添加不會(huì)改善動(dòng)物的產(chǎn)蛋性能。本試驗(yàn)中,飼糧維生素E添加水平為12.5 mg/kg時(shí),蛋種鴨可獲得最好的產(chǎn)蛋性能,推薦在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。
本研究中,飼糧維生素E添加水平對蛋種鴨蛋品質(zhì)沒有顯著影響,以往的研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果不盡相同。研究發(fā)現(xiàn),飼糧添加維生素E對蛋雞[14]、種雞[20-21]及攸縣麻鴨[15]的蛋黃顏色、哈氏單位、蛋殼厚度和蛋殼重均無顯著影響,與本試驗(yàn)結(jié)果一致。令狐克川等[17]研究則發(fā)現(xiàn),飼糧添加200 mg/kg天然維生素E可顯著提高試驗(yàn)第21天雞蛋的蛋白高度、哈氏單位和蛋殼厚度。產(chǎn)蛋后期因蛋禽本身生理機(jī)能的下降和蛋重的增加,對營養(yǎng)物質(zhì)的需要量會(huì)有不同程度的增加,因此,飼糧營養(yǎng)物質(zhì)對禽蛋蛋品質(zhì)的影響可能與蛋禽產(chǎn)蛋階段有關(guān)。在本試驗(yàn)中,蛋種鴨處于產(chǎn)蛋高峰期,飼糧維生素E添加水平對蛋品質(zhì)沒有顯著的提升效果。
MDA是活性氧與抗氧化防御系統(tǒng)相互作用后的最終產(chǎn)物。本研究發(fā)現(xiàn),飼糧添加維生素E可降低蛋種鴨血漿、肝臟和蛋黃中MDA含量,但對GSH-Px活性等其他抗氧化指標(biāo)沒有顯著影響。以往的研究也獲得了類似的結(jié)果,飼糧添加維生素E顯著降低了蛋雞血漿[15]及肝臟[17]MDA含量;飼糧添加40 mg/kg維生素E可以降低儲(chǔ)存12周的蛋黃MDA含量[22];飼糧添加160 mg/kg維生素E可以降低種雞及其后代小雞血漿MDA含量,后代小雞大腦MDA含量,但血漿GSH-Px和SOD活性沒有顯著變化[3,23]。在肉雞的研究中,飼糧添加維生素E可提高產(chǎn)肉量并降低胸肌及腿肌MDA含量,但不會(huì)改變T-AOC及GSH-Px、SOD等抗氧化酶活性[24]。以上結(jié)果均與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。抗氧化防御系統(tǒng)包括酶促和非酶抗氧化防御系統(tǒng),以此保護(hù)生物體免受氧化損傷[25]。而在家禽中,抗氧化酶主要包括SOD、過氧化氫酶和GSH-Px,而非酶抗氧化防御劑主要包括維生素C、維生素E、維生素A以及其他一些抗氧化劑[24]。維生素E屬于非酶促抗氧化防御,在維生素E供應(yīng)充足的情況下,可直接清除自由基,不影響酶促抗氧化防御系統(tǒng),從而并未影響這些抗氧化酶活性[26]。Nrf2是一種重要的氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子。它誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ⅱ期解毒酶和抗氧化酶的組成型和誘導(dǎo)型表達(dá),有利于改善機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài),促進(jìn)細(xì)胞存活,維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)[27-28]。本研究中,飼糧添加維生素E可下調(diào)蛋種鴨肝臟中Nrf2的表達(dá)。據(jù)推測,飲食中的維生素E清除了體內(nèi)的自由基,降低了體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的水平,降低了蛋鴨機(jī)體應(yīng)激水平,從而降低了肝臟Nrf2 mRNA相對表達(dá)量。維生素E的添加是否會(huì)以其他方式影響GSH-Px活性和GPX-1基因的表達(dá),尚需進(jìn)一步研究。因此,本試驗(yàn)中在蛋鴨飼糧中添加維生素E通過非酶促反應(yīng)系統(tǒng)降低了蛋鴨血漿、肝臟和蛋黃中MDA含量,降低了蛋種鴨機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平。
① 蛋種鴨飼糧維生素E添加水平為12.5 mg/kg時(shí)可獲得最好的產(chǎn)蛋率、日產(chǎn)蛋重及料蛋比,更高的維生素E添加水平對產(chǎn)蛋性能沒有顯著的改善作用。
② 蛋種鴨飼糧添加維生素E可降低其血漿、肝臟和蛋黃脂質(zhì)過氧化水平,提高機(jī)體抗應(yīng)激水平。