曹秋梅 丁麗敏* 付小雨 張曉斌

(1.中國農業(yè)大學動物科學技術學院，北京100193；2.安貝(北京)寵物食品有限公司，北京100096；3.懷來安貝寵物食品有限公司，懷來075400)

蛋白質是寵物生長發(fā)育的物質基礎，對保證機體代謝和維持組織細胞更新有非常重要的作用。目前，蛋白質水解物是寵物食品中應用較廣泛的一種優(yōu)質蛋白質飼料原料來源。通過水解動物性蛋白質產生的易于消化吸收的特定小肽和多肽可以促進寵物生長發(fā)育，降低寵物過敏反應，并提高寵物食品的適口性[1]。蛋白質水解物也是產生具有抗氧化和降血壓等功能的生物活性肽的重要途徑，對治療寵物疾病、保證寵物健康和長壽有積極作用[2]。另外，我國蛋白質飼料資源短缺，寵物犬、貓對動物性蛋白質飼料原料數量和質量的需求也日益增高。通過蛋白酶解技術處理動物產品加工的副產品(以下簡稱“動物副產品”)生成蛋白質水解物，并利用其進行寵物食品的生產，不僅可以滿足寵物犬、貓?zhí)囟ǖ臓I養(yǎng)物質需求，而且有益于提高蛋白質飼料資源利用率，增加動物副產品附加值，對于減少環(huán)境污染、實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展也有重要價值[3]。

1 蛋白質水解物概述

蛋白質水解物是蛋白質飼料在酸、堿、酶或微生物作用下產生的富含小肽、多肽和游離氨基酸等成分的混合物。與完整蛋白質相比，水解蛋白質可促進寵物消化道內蛋白質的消化和吸收，促進肽的產生和轉化，提高血漿中氨基酸的利用率，是高度易消化吸收蛋白質的來源[4-5]。蛋白質水解可以產生有生理活性的肽段。水解大豆蛋白衍生的生物肽已被證明有免疫調節(jié)、抗氧化、降血壓、降低膽固醇、抗癌等特性[6]。蛋白質水解物對于開發(fā)維持動物健康和生長的抗生素的替代品有重要意義。另外，水解蛋白質可以充分利用動物副產品(如內臟、血液、羽毛等)，為動物飼糧中動物副產品的應用提供了可能[7]。Grazziotin等[8]研究證實，微生物角化酶水解雞羽毛粉(羽毛粉的蛋白質消化率低于10%)可使其蛋白質消化率提高5倍，而深度水解使羽毛幾乎完全被消化。可用于水解的蛋白質原料一般包括魚肉類、乳清蛋白、酪蛋白等動物性蛋白質和豆類、谷類等植物性蛋白質。由于犬、貓?zhí)囟ǖ牡鞍踪|與必需氨基酸需要，動物副產品的蛋白質水解物是寵物食品中廣泛使用的蛋白質來源，如酶解的雞肉粉、肉骨粉、魚粉、雞肝粉等[9-10]。蛋白質的水解一般采用化學法、酶解法、微生物發(fā)酵法。酶解法由于反應條件溫和、產物質量高，被認為是水解蛋白質的首選方法[7]。

2 蛋白質水解物的消化吸收

肽是蛋白質水解的主要產物。近年來，隨著人們對肽營養(yǎng)及蛋白質周轉代謝的深入研究，發(fā)現(xiàn)小肽可以通過肽載體被直接吸收進入血液循環(huán)，并且已經有研究證明，氮源以小肽形式組成的飼糧要比以氨基酸或完整蛋白質形式組成的飼糧蛋白質沉積效率高[11]。小肽在蛋白質營養(yǎng)過程中發(fā)揮重要的作用。蛋白質進入寵物消化道后，在消化道蛋白酶的作用下被分解，大部分會生成小肽，小部分生成氨基酸。游離氨基酸通過不同的鈉離子轉運系統(tǒng)逆濃度梯度主動運輸進入腸細胞(耗能)。小肽與游離氨基酸進入腸細胞方式類似，是通過腸細胞頂膜上的肽轉運載體小肽轉運蛋白1(PepT1)被吸收(不耗能)。小肽被腸細胞攝入后，在肽酶作用下進一步水解，最終以小肽或游離氨基酸形式進入血液循環(huán)，參與寵物體內的代謝過程[12]。小肽具有特殊的營養(yǎng)生理功能，研究表明，小肽可以促進動物體內蛋白質的合成，提高礦物質的吸收速率，增強機體免疫力，維持腸道健康等[13]。小肽發(fā)揮作用的機制與其吸收特點有關。首先，在吸收速度上，小腸黏膜吸收以肽形式存在的氨基酸的速度要優(yōu)于混合游離氨基酸；其次，小肽形式可以使一些不穩(wěn)定和不溶性的氨基酸被吸收，如半胱氨酸、谷氨酸等，增加血液中氨基酸的利用效率，也使其更平衡。另外，與等量的游離氨基酸相比，小腸中細菌對小肽的分解代謝率低，有些肽還對動物胃腸道的形態(tài)和功能有一定的調節(jié)作用，如降低胃酸分泌、調節(jié)腸道菌群、免疫調節(jié)作用等[14]。

3 生物活性肽

蛋白質水解是產生生物活性肽的重要途徑。生物活性肽中疏水性氨基酸含量高，分子質量小于6 000 Da，一般由2～20個氨基酸組成，也可能含有更多的氨基酸，如具有肽-C結構的胰島素。生物活性肽具有類似激素功能，在降血壓、抗氧化、抗菌、抗凝血、碳水化合物代謝等方面都發(fā)揮著重要作用[6]。

3.1 抗氧化

生物活性肽可以表現(xiàn)出比天然抗氧化劑，如α-生育酚，甚至合成抗氧化劑更好的抗氧化活性[15]。它們通過清除自由基、提供電子或螯合金屬(如鐵)而發(fā)揮抗氧化作用。一般來說，低分子質量(0.5～1.5 kDa)、結構上含有疏水性和芳香族氨基酸的肽具有較好的抗氧化活性。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，從鴨肉酶解中提取的多肽對自由基的清除能力強，具有較強的抗氧化活性。Chakka等[17]研究證實了雞肝蛋白酶解肽與發(fā)酵肽均具有較好的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)及超氧陰離子自由基清除活性和還原活性。吳偉菁等[18]探究了不同蛋白酶水解苦蕎蛋白對其產物抗氧化活性的影響，結果表明，隨著水解程度的增加，水解產物抗氧化活性不斷增強，是良好的抗氧化劑來源。吳明澤等[19]對中華圓田螺肉進行酶解制備抗氧化肽，并進行小鼠體內抗氧化酶活性測定試驗，結果表明，分子質量<1 kDa的肽的抗氧化活性最強，分離出的混合物抗氧化肽純度可達到90%。

3.2 抗菌

生物活性肽也具有抗菌活性。多肽的凈正電荷使它們能夠通過靜電力與陰離子細菌膜通信，并在水介質中形成兩親性結構。因此，抗菌肽與微生物的最初相互作用是通過與脂質結合，滲透到細菌磷脂層，破壞細胞膜的通透性和結構，阻止細胞內核酸和蛋白質的合成，從而發(fā)揮抗菌作用的[20]?？咕牡目咕钚耘c其理化性質以及氨基酸的數量和類型有關，多肽的理化性質，如其大小、電荷、疏水性、兩親性和溶解度等，對其抗菌活性至關重要[21]。具有抗菌活性的多肽通常富含陽離子和疏水氨基酸，具有陽離子(帶正電)和兩親性(親水和疏水)特征。Gómez-Guillén等[22]利用堿性蛋白酶從金槍魚和魷魚皮的水解明膠中提取出具有抗菌和抗氧化活性的多肽，揭示分子質量較低的多肽具有較高的抗菌和抗氧化活性。Hedhili等[23]和Lafarga等[24]研究發(fā)現(xiàn)，牛血紅蛋白水解物、牛肉肌漿蛋白水解物、魷魚皮蛋白水解物均含有抗菌肽，可作為治療動物疾病的抗菌素或抗生素佐劑。雖然市場上有許多抗生素比這些抗菌肽具有更強的殺菌效果，但抗菌肽由于不產生抗藥性、無殘留、殺菌速度快、活性范圍廣而具有獨特優(yōu)勢。

3.3 抗癌

蛋白質水解可以產生具有抗癌活性的多肽，這與其氨基酸組成、序列和長度有關。生物活性肽中短鏈的氨基酸和疏水氨基酸與抗癌活性有密切的關系。Halim等[25]使用堿性蛋白酶將鰻魚肉酶解并通過膜過濾器(10、5和3 kDa)分級分離，結果表明，3 kDa鰻魚蛋白水解物具有最高的脂質過氧化抑制能力、還原力、DPPH清除活性和抗癌活性。Sheih等[26]從藻類蛋白廢料中提取出分子質量為1 309 Da的肽，發(fā)現(xiàn)其可以抑制胃癌細胞的生長并促進細胞周期停滯，表現(xiàn)出良好的抗癌活性。研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣蛋白水解產生的分子質量為515.29 Da的肽序列Leu-Ala-Asn-Ala-Lys對人結腸癌(HT-29)細胞株具有抗癌活性[27]。豆類的蛋白質水解物可以作為抗癌劑，是治療癌癥的有效來源[6]。León-Espinosa等[28]通過對蠶豆進行水解，發(fā)現(xiàn)水解豆蛋白(蠶豆)對結直腸癌患者具有降血糖和抗癌作用。

3.4 降血壓

血管緊張素轉化酶(ACE)可催化非活性血管緊張素Ⅰ轉化為血管緊張素Ⅱ，是一種有效的血管收縮劑。蛋白質水解產生的生物活性肽可通過抑制ACE活性，使血壓降低。ACE的天然抑制劑通常由短序列氨基酸組成，比合成藥物更能保證降低血壓，而且沒有任何長期的副作用。多肽的氨基酸組成和分子質量決定其活性。研究表明，芝麻蛋白消化液(SPDS)經不同分子質量截留(MWCO)膜超濾純化，SPDS-Ⅶ(<3 kDa)對ACE抑制作用最強[29]。肉類或牛奶蛋白水解產生的多肽是有活性的ACE抑制劑的來源[14]。Yang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，長期服用大豆水解蛋白可以通過抑制ACE的作用，延緩自然高血壓小鼠的血壓升高。Roslan等[31]酶解羅非魚蛋白質后發(fā)現(xiàn)其ACE抑制活性高達88.26%，具有較強的降血壓功能。

3.5 免疫調節(jié)

生物活性肽具有免疫活性，可以提高動物的免疫能力。少于20個氨基酸殘基、富含精氨酸、賴氨酸和脯氨酸殘基的肽段具有誘導免疫調節(jié)和抗菌等有益作用[32]。沈一茹等[33]以肉雞為研究對象，探究大豆酶解蛋白對其生長性能及免疫器官發(fā)育的影響，飼喂42 d后發(fā)現(xiàn)肉雞料重比顯著降低，生長性能與免疫能力均有所提高。吳遠彩等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加1%～2%的小肽可提高凡納濱對蝦幼蝦血清中非特異性免疫酶酚氧化酶(PO)和酸性磷酸酶(ACP)的活性，有利于增強其非特異性免疫力和抗病力。Ashaolu等[35]的一項研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白的胃蛋白酶酶解產物可改善大鼠的免疫系統(tǒng)，其作用機制是刺激脾細胞增殖并表現(xiàn)出吞噬活性；用大豆蛋白水解液喂養(yǎng)大鼠后，血清免疫球蛋白G、免疫球蛋白A含量明顯升高。

4 蛋白質水解物的制備

4.1 化學法

蛋白質水解的化學處理包括使用酸或堿來裂解肽鍵。水解植物性蛋白質一般是用無機酸(通常為4～6 mol/L鹽酸)在100～130 ℃下處理4～24 h，然后用氫氧化鈉中和得到[36]。堿水解法一般采用強堿(如4 mol/L氫氧化鈉或氫氧化鉀等堿水解劑)在105 ℃高溫下反應20 h將蛋白質完全水解[37]。堿水解法在食品和飼料應用中不太常見，因為在堿性條件下的熱處理會產生有毒物質，導致L-氨基酸外消旋轉為不能利用的D-氨基酸，并會破壞部分氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸等[38]。盡管酸水解法比堿水解法更受歡迎，但酸水解過程會破壞色氨酸和半胱氨酸的結構，將谷氨酰胺和天冬酰胺分別轉化為谷氨酸和天冬氨酸[39]。此外，酸水解法和堿水解法都不存在專一性，不能有選擇性地水解某些氨基酸肽鍵，中和過程會在最終產品中產生大量的鹽。一般來說，基于化學水解的工藝產生的蛋白質水解物營養(yǎng)價值降低，功能性差，僅限于用作風味增強劑[40]。

4.2 酶解法

酶解法是蛋白質水解制備生物活性肽非常有效的方法[41]。酶解法選用的酶包括堿性蛋白酶、風味酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶等，一般來源于微生物、動物或植物。微生物來源的酶比其他來源的酶具有更高的耐熱性、高pH和適當的蛋白質水解特性。堿性蛋白酶被發(fā)現(xiàn)是魚蛋白水解的一種高效酶，因為它能夠在溫和的條件下在相對較短的時間內達到高度的水解，并能產生具有良好營養(yǎng)和功能性質的魚蛋白水解物[42]。水解蛋白質可以采用單一酶完成，也可以采用多種酶復合完成。酶的選擇取決于蛋白質的種類和需要的水解程度。例如，水解含有較多疏水性氨基酸的蛋白質，需優(yōu)先選擇可裂解氨基酸肽鍵的酶[14]。酶解是利用酶作用于底物在適當的條件下進行的過程，酶的種類、pH、時間、溫度、酶底物比、固液比和加酶量的不同，所得產物的生物活性也有所不同。酶解是一種特殊的工藝，易于控制水解程度，水解條件溫和，可最大程度減少蛋白質底物的營養(yǎng)損失，保留原蛋白質的營養(yǎng)價值。

4.3 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法是利用微生物在適宜條件下產生的蛋白酶將蛋白質水解為多肽和游離氨基酸的方法。通過微生物的代謝和發(fā)酵活動可以產生具有不同氨基酸序列和分子質量的各種活性多肽，也是生產生物活性肽的重要方式。微生物發(fā)酵酶解常選用的菌株包括細菌、霉菌和酵母等，如枯草芽孢桿菌、米曲霉、乳酸桿菌和酵母菌[43]。不同的菌株對蛋白質原料的作用是不同的，枯草芽孢桿菌對豆類蛋白水解效果較好，乳制品的生產常選用乳桿菌或乳球菌。微生物發(fā)酵受多個因素的影響，主要包括微生物菌株類型、蛋白質來源、發(fā)酵時間和溫度等[44]。微生物發(fā)酵不僅可以分解蛋白質為多肽和游離氨基酸，它還可以除去蛋白質原料中的超過敏和抗營養(yǎng)因子。微生物發(fā)酵過程中產生的酶能分解蛋白質原料中的脂肪和魚腥味物質，使產品具有更好的感官品質或獨特的發(fā)酵香氣[45]。另外，微生物發(fā)酵酶解還會產生一些有抗菌活性的肽段，可以降低疾病的發(fā)病率；產生的芳香物質對提高食物的適口性也有重要作用。王文娟等[46]采用微生物發(fā)酵技術酶解豆粕原料，最終制得的大豆肽具有很好的風味和生理特性。

5 蛋白質水解物在寵物食品中的應用

5.1 促進養(yǎng)分消化吸收

蛋白質、氨基酸等營養(yǎng)物質是寵物食品不可缺少的重要組成成分，營養(yǎng)物質的消化吸收直接影響著寵物的生長發(fā)育。原料蛋白質水解后相當于預消化，可大大提高寵物對蛋白質和氨基酸的消化率，促進寵物的生長。Martínez-Alvarez[47]研究發(fā)現(xiàn)，通過蛋白質水解獲得的特定的類激素肽可以調節(jié)動物胃腸道運動、內分泌和養(yǎng)分的攝入，并對其生長性能產生積極影響。Tjernsbekk等[48]用酶解的三文魚蛋白水解物制備寵物膨化食品，發(fā)現(xiàn)其粗蛋白質和氨基酸的表觀總消化率顯著提高。Pinto等[49]將水解雞肝粉(HCLP)加入到成年犬飼糧中，結果發(fā)現(xiàn)HCLP由于某些必需氨基酸和脂肪酸的含量較高，可滿足成年犬的營養(yǎng)需求，并且添加258 g/kg HCLP可提高犬對飼糧的接受性和消化率。

5.2 降低過敏性

食物中的蛋白質是引起寵物過敏反應的主要原因之一，蛋白質的類型以及含量均影響寵物的過敏性。例如，谷蛋白會導致寵物患谷蛋白敏感腸病，高濃度的蛋白質不僅容易引起寵物的過敏反應，還容易形成生物胺，產生毒性作用，給寵物健康帶來危害[50]。蛋白質通過水解會將大的多肽鏈分解成較小的多肽和氨基酸，降低分子質量，從而降低原始蛋白質的抗原性，減少過敏反應。一般蛋白質水解物的平均分子質量分布在800～1 500 Da，不具有致敏性[1]。Olivry等[51]在寵物(如犬和貓)飼糧中添加家禽副產品的水解物，通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和血清學試驗發(fā)現(xiàn)其具有抗過敏作用，可大大減少寵物的過敏問題。Weemhoff等[52]和Noli等[53]研究發(fā)現(xiàn)，水解蛋白質飲食可以通過降低食物成分的過敏性，有效診斷和治療犬和貓的食物不良反應。

5.3 提高適口性

食物的適口性是影響寵物采食量的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質經過水解后產生的短肽和游離氨基酸，可以改善食物的適口性。蛋白質水解物由于含有較高濃度的短肽和游離氨基酸，是商業(yè)貓糧中最受歡迎的適口性增強劑之一。Folador等[54]報道了鮭魚蛋白水解物(SPH)有較高的氨基酸消化率，當提供給犬時，發(fā)現(xiàn)含有SPH的膨化犬糧具有很好的適口性。Nchienzia等[55]研究發(fā)現(xiàn)，低灰分家禽粉用商業(yè)蛋白酶Alcalase、Flavourzyme、Protamex和Liquipanol處理后，其水解物對提升寵物食品的口感很重要，其中相對便宜的水解家禽粉可用于改善寵物食品的風味。陳曉[56]利用胰酶水解雞肝蛋白，發(fā)現(xiàn)結合美拉德反應制備的犬糧誘食劑，可大大提高犬糧的適口性。郭艷霞[57]發(fā)現(xiàn)，利用動物水解專用酶和木瓜蛋白酶水解雞肉與酶解前相比，可以改善犬糧風味特性，提高犬采食量。

5.4 促進礦物元素吸收

礦物元素是寵物生長發(fā)育非常重要的營養(yǎng)素，寵物缺鈣會導致幼犬患佝僂病、成犬患軟骨病、老年犬患骨質疏松，還會導致犬出現(xiàn)食欲不振、精神萎靡和異食癖等癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質水解后得到的小肽可以作為Ca2+跨膜運輸的載體，與Ca2+螯合后生成肽螯合鈣，其吸收效率高，是良好的寵物鈣補充劑來源[58]。郭麗麗等[59]在對礦物元素吸收肽的研究過程中發(fā)現(xiàn)，當水解液pH為8.0、水解100 min、45 ℃溫度條件下，利用胰蛋白酶酶解乳清蛋白制備的肽體外持鈣活性最強，具有良好促進鈣吸收的能力。

5.5 抗氧化作用

寵物通過正常的細胞活動和各種應激會源源不斷產生自由基。這些自由基可以摧毀寵物的防御系統(tǒng)，導致疾病，并可能加重遺傳易感性疾病，如犬髖關節(jié)發(fā)育不良(CHD)、慢性阻塞性肺疾病或關節(jié)炎。因此，在飲食中加入抗氧化劑可以通過滅活有害的自由基來對寵物健康發(fā)揮重要作用[60]。生物活性蛋白水解物是天然的、更安全的抗氧化劑的潛在來源。大量研究表明，米糠蛋白、牛奶酪蛋白、大豆蛋白、高粱蛋白和玉米蛋白所產生的水解物或生物活性肽在體外和體內均顯示出較高的抗氧化活性。寵物食品是含脂肪的產品，脂質含量可以從5%～40%[61]。防止脂質氧化對于寵物的健康以及保持寵物食品的質量是很必要的。Hu等[62]對酒糟水溶性干谷物蛋白進行酶解，發(fā)現(xiàn)其水解物可減少寵物食品的脂質氧化過程，大大延長了寵物食品的保質期。Wang等[63]研究表明，火雞肉在最佳水解條件下(50.1 ℃、1.1 h、pH 5.4)通過風味酶水解，該蛋白質水解物可作為天然抗氧化劑的潛在來源，在寵物功能性食品中的應用有重要意義。蛋白質水解物作為寵物食品的天然抗氧化劑，不僅可以抑制寵物食品的脂質氧化，還可能改善寵物的健康。

5.6 保健功能

蛋白質水解物是很有前途的保健品，其具有一系列潛在的生物活性，包括抗氧化、抗高血壓、免疫調節(jié)等，對寵物疾病的治療有重要作用。Zóia Miltenburg等[64]在擠壓飼糧中添加酶解禽副產物粕(HPM)，發(fā)現(xiàn)其可抑制貓血清ACE活性，在不影響消化率的情況下促進其形成良好的糞便稠度。蛋白質水解物飲食可以作為寵物炎癥性腸病(IBD)藥物治療的有效輔助手段，在6只患有頑固性IBD的犬中，有4只單獨使用大豆水解物飲食治療后臨床癥狀緩解，組織病理學改善[65]。蛋白質水解物飲食由于可以促進養(yǎng)分消化和降低食物抗原性，有助于治療胰腺外分泌功能不全(EPI)。Biourge等[66]將以大豆和雞肉為基礎的蛋白質水解物飼喂給3只患有EPI的德國牧羊犬，結果發(fā)現(xiàn)在開始喂養(yǎng)的3周內，3只犬的糞便質量、皮膚病體征和體重都有所改善。超重和肥胖被認為是貓日益嚴重的問題，這會對健康產生重要的影響。通過腸道屏障的轉運研究，Theysgeur等[67]從羅非魚副產物水解物中鑒定出了能夠刺激膽囊收縮素(CCK)和胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)分泌并抑制二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)活性的新型生物活性肽，證明了羅非魚副產品水解物似乎有希望預防和管理超重肥胖問題。

6 小結與展望

蛋白質飼料通過化學、酶或微生物水解后可以產生易消化吸收的寡肽、生物活性肽和特定氨基酸，對保證寵物的營養(yǎng)、維護寵物健康起著重要的作用。目前，蛋白質水解物廣泛應用于寵物食品工業(yè)的食品配方中，以確保產品低過敏性、高消化性和高適口性，是商業(yè)犬糧、貓糧中最受歡迎的蛋白質飼料原料之一。蛋白質水解物由于其具有抗氧化、抗菌、免疫調節(jié)、抗癌等特性，也是很有前途的寵物保健品，對寵物食品中功能性產品的開發(fā)有重要意義。盡管人們對蛋白質水解物生物學效應的了解越來越多，但對其肽鏈分子結構的認識還較少，應增加特定功能肽段的具體結構特點的研究。此外，要了解含有蛋白質水解物的飲食對寵物生長和健康的影響，有必要更廣泛、更深入地了解蛋白質水解物中生物活性肽的產生機制及提純鑒定方法，并進行活體評估?？傊?，蛋白質水解物在寵物食品中有很好的應用前景，既可以作為必需氨基酸或氮的來源，也可以作為具有生物活性潛力的成分的來源。相信在不久的未來，蛋白質水解物可以在寵物行業(yè)發(fā)揮重要的價值。