宋興亞，彭 巍，劉 賢，姚 治，張子敬，雷初朝，王二耀，黃永震*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海大學(xué)，青海西寧 810016；3.河南省畜牧總站，河南鄭州 450008；4.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州 450002）

RNA 表觀遺傳修飾是轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)RNA 調(diào)控的關(guān)鍵所在，發(fā)生在轉(zhuǎn)錄組中，對(duì)于動(dòng)物體內(nèi)多種生命進(jìn)程發(fā)揮著極其重要的作用?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)了170 余種RNA 修飾，能夠改變RNA 中所含堿基的電荷以及堿基配對(duì)特性，使RNA 發(fā)生空間構(gòu)象上的變化。mA 甲基化修飾在真核生物mRNA 的甲基化修飾形式中豐度最高，是目前RNA 表觀遺傳修飾的熱門研究方向之一。本文綜述了mA 甲基化修飾和脂肪生成的基本過(guò)程以及mA 甲基化修飾影響脂肪生成的機(jī)制，以期為研究動(dòng)物脂肪調(diào)控提供新思路。

1 m6A 甲基化修飾概述

mA 甲基化修飾是指發(fā)生在RNA 中腺苷酸第6 位N 通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶催化形成的甲基化修飾，其出現(xiàn)在高度保守的序列上，主要發(fā)生在RRACH（R 為A/G；A 為mA 甲基化修飾位點(diǎn)；H 為A/U/C）序列的腺嘌呤上，且其主要分布在終止密碼子附近、3’-非翻譯區(qū)（3'-UTRs）、mRNA 外顯子及編碼區(qū)（CDS）。mA 甲基化修飾主要依靠甲基轉(zhuǎn)移酶（Writers）、去甲基化酶（Erasers）和結(jié)合蛋白（Readers）多種蛋白共同調(diào)控來(lái)完成，圖1 較為直觀地呈現(xiàn)了這一過(guò)程，并包括了mA 酶系統(tǒng)的主要成員和其各自發(fā)揮的作用。

圖1 m6A 甲基化修飾酶系主要蛋白及分子機(jī)制示意圖[10]

1.1 mA 酶系統(tǒng)

1.1.1 甲基轉(zhuǎn)移酶 mA 修飾由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體（MTC）所介導(dǎo)，也被稱為甲基轉(zhuǎn)移酶。其中的主要成分有甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（METTL3）、METTL14、METTL16、RNA 結(jié)合模體蛋白15（RBM15）、成腎細(xì)胞瘤1-結(jié)合蛋白（WTAP）、CCCH 型鋅指蛋白13（ZC3H13）等。

METTL3、METTL14 和WTAP 是甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體中的重要組分。METTL3 是在哺乳動(dòng)物中第1 個(gè)被鑒定出來(lái)的mA 甲基轉(zhuǎn)移酶，其對(duì)應(yīng)的基因高度保守，在大量不同物種中都存在其同源蛋白。METTL14 可與METTL3 等比例形成二聚體，相互之間起到協(xié)同作用，增強(qiáng)兩者的催化能力。WTAP 再與METTL3 和METTL14 的二聚體結(jié)合形成復(fù)合體，加快mA 甲基化進(jìn)程，并對(duì)該過(guò)程進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控。有研究表明，WTAP對(duì)胚胎發(fā)育起著非常重要的作用，其缺失會(huì)引起細(xì)胞分化能力減弱甚至喪失，使胚胎無(wú)法存活。敲除小鼠胚胎干細(xì)胞中的基因，顯著降低了mRNA 整體的mA 水平，并且影響干細(xì)胞的自我修復(fù)，進(jìn)而影響干細(xì)胞分化。

1.1.2 去甲基化酶 去甲基化酶的催化作用實(shí)現(xiàn)了RNA主動(dòng)完成去甲基化過(guò)程。去甲基化酶主要包括同屬于AlkB 家族的肥胖關(guān)聯(lián)蛋白（FTO）、AlkB 同源蛋白5（ALKBH5）、ALKBH1 和ALKBH3?；虮话l(fā)現(xiàn)之初，人們把它當(dāng)作肥胖關(guān)聯(lián)基因，之后研究發(fā)現(xiàn)FTO 也在mA 甲基化修飾中發(fā)揮著去甲基化酶的功能，且FTO 是最早被發(fā)現(xiàn)的mA 去甲基化酶，該發(fā)現(xiàn)證實(shí)了mA 甲基化修飾這一過(guò)程是可逆的。FTO 廣泛存在于全年齡段生命的組織細(xì)胞中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)水平尤其高，能夠有效去除mRNA 上的mA 修飾；ALKBH5 存在于大部分組織的細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)調(diào)控mRNA 運(yùn)輸過(guò)程發(fā)揮其去甲基化的作用。有研究表明，這些去甲基化酶都是通過(guò)相同的途徑發(fā)揮作用，即先把mA 氧化為N-羥甲基腺苷（hmA），然后轉(zhuǎn)變?yōu)镹-甲酰腺苷（fA），最后變?yōu)橄佘铡?/p>

1.1.3 結(jié)合蛋白 含有mA 甲基化修飾的蛋白質(zhì)若想行使其特殊的功能，需要先與結(jié)合蛋白結(jié)合，才能實(shí)現(xiàn)其特定的功能。已知哺乳動(dòng)物中存在的mA 結(jié)合蛋白主要包括YTH 結(jié)構(gòu)域包含蛋白（YTHDC）、核不均一核糖核蛋白（hNRNPs）、胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA 結(jié)合蛋白（IGF2BPs）和真核起始因子3（elF3）等。有研究證明，YTH 結(jié)構(gòu)域通過(guò)特異性識(shí)別達(dá)到結(jié)合蛋白與mRNA 上的mA 位點(diǎn)特異性結(jié)合的目的，使結(jié)合蛋白發(fā)揮相應(yīng)的功能，從而對(duì)mRNA 的選擇性剪接與結(jié)構(gòu)改變進(jìn)行直接調(diào)控或間接調(diào)控。

1.2 mA 在動(dòng)物中的生物學(xué)功能 mA 甲基化修飾在動(dòng)物的轉(zhuǎn)錄組中廣泛存在，使得生長(zhǎng)發(fā)育、癌癥治療、畜禽育種等多領(lǐng)域工作者對(duì)mA 甲基化修飾的關(guān)注度提高，mA 更多的生物學(xué)功能也逐漸浮現(xiàn)在大眾的視野當(dāng)中。

1.2.1 調(diào)控干細(xì)胞分化 細(xì)胞分化是生物生長(zhǎng)發(fā)育最重要的生命過(guò)程之一，而多種發(fā)育調(diào)控因子對(duì)應(yīng)的mRNA 的穩(wěn)定性與mA 甲基化修飾的水平呈負(fù)相關(guān)，Geula 等研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠胚胎干細(xì)胞中的基因，細(xì)胞中的mA 甲基化修飾水平降低，胚胎干細(xì)胞的自我更新能力和分化能力也隨之受到抑制，胚胎的早期發(fā)育會(huì)極度受限，導(dǎo)致死亡。

1.2.2 調(diào)控器官發(fā)育 在所有器官中，大腦是mA 甲基化修飾水平及其相關(guān)蛋白表達(dá)豐度最高的器官之一。有研究表明，敲除小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的基因會(huì)高度抑制大腦皮層及小腦發(fā)育，而敲除基因會(huì)嚴(yán)重影響大腦皮質(zhì)發(fā)育。

1.2.3 影響癌癥發(fā)生 mA 甲基化修飾在癌癥發(fā)生的過(guò)程中扮演著極其重要的角色。METTL14 在急性骨髓白血?。ˋML）中抑制AML 細(xì)胞系的終末髓樣分化，并促進(jìn)其增殖，通過(guò)對(duì)致癌基因與的mA 甲基化修飾水平進(jìn)行調(diào)控使其發(fā)揮致癌作用。Barbieri等研究證明，啟動(dòng)子結(jié)合的METTL3 在相關(guān)mRNA對(duì)應(yīng)的編碼區(qū)內(nèi)誘導(dǎo) mA 甲基化修飾，并通過(guò)緩解核糖體停滯來(lái)加強(qiáng)其翻譯，從而影響急性骨髓白血病的發(fā)展，該研究將甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3 確定為AML 的潛在治療靶點(diǎn)。

1.2.4 影響生殖性能 Yuan 等運(yùn)用全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）篩選出包括去甲基酶ALKBH5 在內(nèi)的許多候選基因會(huì)對(duì)小鼠睪丸的大小和發(fā)育產(chǎn)生較大影響。mA 的高水平存在是弱精子癥的危險(xiǎn)因素并影響精子活力，而甲基轉(zhuǎn)移酶，尤其是 METTL3，在增加精子RNA 中的mA 含量方面起著關(guān)鍵作用。

1.2.5 影響肌肉發(fā)育 丁浩等通過(guò)對(duì)比雞骨骼肌細(xì)胞各個(gè)時(shí)期去甲基化酶基因和的表達(dá)水平，以及對(duì)應(yīng)時(shí)期mA 甲基化修飾水平，推測(cè)ALKBH5 和FTO 可能通過(guò)調(diào)控mA 水平來(lái)影響雞的骨骼肌發(fā)育。

2 動(dòng)物脂肪生成概述

動(dòng)物的脂肪組織主要分布在機(jī)體的皮下、肌肉組織或內(nèi)臟周圍等。皮下過(guò)多地生成脂肪會(huì)大幅降低動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而影響畜牧生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。而脂肪含量與肉產(chǎn)品質(zhì)量存在密切關(guān)系，會(huì)影響動(dòng)物肉質(zhì)的色澤、風(fēng)味以及嫩度等，因此調(diào)節(jié)不同部位的脂肪組織生成與沉積一直是肉用動(dòng)物研究的熱門。

2.1 脂肪細(xì)胞生成過(guò)程 脂肪細(xì)胞是由起源于中胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(lái)，其生成需要經(jīng)過(guò)以下幾個(gè)步驟：首先由多能的間充質(zhì)干細(xì)胞“定型”分化專能的前脂肪細(xì)胞，然后前脂肪細(xì)胞再向脂肪細(xì)胞進(jìn)行“終末分化”，最后以聚酯的形式形成成熟的脂肪細(xì)胞。脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)包括脂肪細(xì)胞數(shù)量的積累以及體積的變化。成熟的脂肪細(xì)胞不具備分裂和分化的功能，因此脂肪細(xì)胞數(shù)量上的積累是依靠前體脂肪細(xì)胞的增殖分化來(lái)完成，而脂肪細(xì)胞體積的增大主要是因?yàn)榘麅?nèi)甘油三酯含量升高所導(dǎo)致。

2.2 脂肪細(xì)胞生成的調(diào)控因子 在脂肪生成和分化的過(guò)程中，許多調(diào)控因子發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用，如過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）、CCAAT/ 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBPs）等。PPAR是脂肪生成和調(diào)控的主要作用因子之一，脂肪細(xì)胞中激活的PPAR保證了脂肪細(xì)胞因子（脂聯(lián)素和瘦素）的平衡和充分分泌，同時(shí)在機(jī)體內(nèi)的糖脂代謝和胰島素信號(hào)傳導(dǎo)也扮演著重要角色。對(duì)于C/EBP，它是C/EBPs 異構(gòu)體之一，其表達(dá)對(duì)自身有著正反饋效應(yīng)，即C/EBP表達(dá)增多后，可誘導(dǎo)自身表達(dá)，形成正反饋。同時(shí)，數(shù)據(jù)匯總的結(jié)果顯示，缺乏PPAR的成纖維細(xì)胞即使在添加了高水平C/EBP的情況下仍無(wú)法向脂肪細(xì)胞分化，由此可得，C/EBP在脂肪生成中發(fā)揮的作用是輔助PPAR完成成脂過(guò)程。

3 m6A 甲基化修飾影響脂肪生成的機(jī)制

mA 會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體的脂肪生成產(chǎn)生影響，主要是去甲基化酶FTO、甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體及其組分METTL3、mA 結(jié)合蛋白IGF2BP1 以及其他重要成脂基因通過(guò)mA 甲基化修飾在動(dòng)物脂肪生成中發(fā)揮作用。

3.1 FTO 表達(dá)水平與脂肪生成呈正相關(guān) 依賴于去甲基化酶FTO 的mA 脫甲基過(guò)程不僅是mRNA 修飾加工的新機(jī)制，該過(guò)程在脂肪分化、形成的調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著尤為關(guān)鍵的作用。

Zhao 等運(yùn)用基因組學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)等生物技術(shù)發(fā)現(xiàn)mA 酶體系中的重要組分——FTO 缺失會(huì)阻礙前體脂肪細(xì)胞（3T3-L1）的分化：在3T3-L1 分化過(guò)程中，mA 修飾區(qū)域集中在外顯子剪切位點(diǎn)附近，并且和mRNA 剪接加工的重要元件SR 蛋白結(jié)合序列具有空間重疊性；干擾表達(dá)可以增加富含絲氨酸/精氨酸剪接因子（SRSF2）對(duì)RNA 的結(jié)合能力，促進(jìn)SRSF2靶基因的外顯子保留，這一過(guò)程在圖2 中有詳細(xì)說(shuō)明；FTO 調(diào)控剪接位點(diǎn)附近的mA 甲基化修飾水平來(lái)控制成脂調(diào)節(jié)因子RuNt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位1（RUNX1T1）的剪切產(chǎn)物，調(diào)控了3T3-L1 的分化。脂肪形成的過(guò)程中，F(xiàn)TO 的表達(dá)水平與mA 修飾水平成反比，F(xiàn)TO的活性降低會(huì)阻止成脂過(guò)程，只有具有催化活性的FTO才能激發(fā)脂肪的形成。

圖2 FTO 依賴性m6A 甲基化修飾和SRSF2 介導(dǎo)的RUNX1T1 的可變剪接示意圖[26]

Jiao 等通過(guò)構(gòu)建基因敲除和過(guò)表達(dá)的前體脂肪細(xì)胞3T3-L1，對(duì)比分析得出FTO 可抑制3T3-L1 細(xì)胞增殖，并使線粒體膜電位和ATP 水平降低；實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了幾種脂質(zhì)代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示敲除后，除抑制了AKT 磷酸化和4 型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT4）的表達(dá)之外，還降低了PPAR的表達(dá)水平。Wang 等敲除小鼠基因，發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白5（ATG5）與自噬相關(guān)蛋白7（ATG7）的表達(dá)降低，YTHDF2 與mA 甲基化修飾水平較高的ATG5 與ATG7 mRNA 結(jié)合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被降解，蛋白質(zhì)表達(dá)減少，從而抑制了自噬與脂肪形成。為確定YTHDF2 是否是FTO 在3T3-L1 細(xì)胞形成脂肪中發(fā)揮作用的主要因素，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行沉默，結(jié)果顯示與對(duì)照細(xì)胞相比，細(xì)胞周期蛋白A2（CCNA2）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）的mRNA 水平升高，G1 期和S 期細(xì)胞周期阻滯消失，G2 期細(xì)胞數(shù)量明顯增多，并且沉默會(huì)使敲除給成脂標(biāo)記物PPAR，C/EBP和脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）帶來(lái)的抑制作用減小或逆轉(zhuǎn)。表明FTO 與YTHDF2 協(xié)同作用通過(guò)影響甲基化介導(dǎo)CCNA2 和CDK2 的表達(dá)途徑，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞周期和脂肪生成過(guò)程。

3.2 METTL3 表達(dá)水平與脂肪生成呈負(fù)相關(guān) Yao 等通過(guò)進(jìn)行qPCR 與Western blots 技術(shù)，發(fā)現(xiàn)沉默基因可顯著促進(jìn)豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（pBMSC）的成脂分化：當(dāng)METTL3 受到干擾時(shí)，JAK1 mRNA 的mA修飾水平下降，從而使其mRNA 的穩(wěn)定性得到增強(qiáng)，激活了Janus 激酶1（JAK1）/ 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子5（STAT5）/C/EBP途徑，使得脂肪生成增多，同時(shí)成脂標(biāo)記物PPAR、C/EBP和FABP4 的表達(dá)受到激發(fā)，表達(dá)水平升高；相反，細(xì)胞中METTL3 的過(guò)表達(dá)明顯抑制了pBMSC 的脂肪生成：當(dāng)METTL3 過(guò)表達(dá)時(shí)，觀察到脂質(zhì)滴減少，并且成脂標(biāo)記物PPAR，C/EBP和FABP4 被明顯抑制。

Kobayashi 等通過(guò)單獨(dú)敲除或過(guò)表達(dá)WTAP、METTL3 和METTL14，發(fā)現(xiàn)這三種組分協(xié)同工作，生成的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體通過(guò)影響在促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化的有絲分裂擴(kuò)增（MCE）過(guò)程中的細(xì)胞周期來(lái)正向調(diào)控脂肪形成。

3.3 IGF2BP1 表達(dá)水平與脂肪生成呈正相關(guān) IGF2BP1是mA 甲基化修飾的“reader”，屬于單鏈RNA 結(jié)合蛋白，可以與胰島素樣生長(zhǎng)因子2（IGF2）mRNA的5' UTR 結(jié)合并調(diào)節(jié)IGF2 的翻譯，在細(xì)胞內(nèi)多個(gè)過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用。已有研究表明IGF2 的過(guò)表達(dá)與兒童肥胖相關(guān)，IGF2 降低了脂肪細(xì)胞中胰島素受體的 mRNA 表達(dá)，并下調(diào)了胰島素受體亞型A（IR-A）和GLUT4 的豐度以及內(nèi)臟脂肪細(xì)胞中相應(yīng)的葡萄糖攝取。IGF2 在小鼠肝臟的過(guò)表達(dá)會(huì)降低體脂。Chen等研究其結(jié)合蛋白IGF2BP1 與雞脂肪生成的關(guān)系，結(jié)果顯示IGF2BP1 可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞的增殖和分化，其過(guò)表達(dá)會(huì)增加脂質(zhì)滴含量。并且在雞肝相關(guān)細(xì)胞系Leghorn 株M 雞肝癌（LMH）細(xì)胞中的異位表達(dá)表明，IGF2BP1 可以調(diào)節(jié)與脂肪酸代謝相關(guān)的基因的表達(dá)，促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖分化，增加脂滴積累。

3.4 其他成脂相關(guān)基因的mA 甲基化修飾影響脂肪生成線粒體載體同源物2（MTCH2）是一種線粒體外膜蛋白，MTCH2 高表達(dá)水平細(xì)胞具有更強(qiáng)的脂肪沉積能力。Jiang 等從金華豬的背最長(zhǎng)肌中已知脂質(zhì)氧化代謝相關(guān)的102 個(gè)mA 甲基化修飾基因選出mA 水平差異最顯著的，研究其mA 甲基化修飾水平對(duì)金華豬脂肪生成的影響，結(jié)果顯示高水平的mA 甲基化修飾可以促進(jìn)金華豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)，可能是通過(guò)增強(qiáng)自身mRNA 的翻譯，促進(jìn)對(duì)應(yīng)蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)脂肪生成。Jiang 等的研究?jī)H在組中發(fā)現(xiàn)敲除基因會(huì)減少M(fèi)TCH2蛋白的水平，而在同義的mA 位點(diǎn)突變組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，基因的過(guò)表達(dá)會(huì)增加MTCH2 蛋白的水平；后續(xù)通過(guò)RIP 實(shí)驗(yàn)揭示了YTHDF1 和MTCH2 mRNA 之間的直接相互作用，表明由mA 介導(dǎo)的翻譯依賴于mA 結(jié)合蛋白——YTHDF1（圖3）。

圖3 MTCH2 以m6A-YTHDF1 依賴性機(jī)制促進(jìn)肌內(nèi)脂肪生成示意圖[38]

4 小 結(jié)

隨著RNA 表觀遺傳學(xué)不斷發(fā)展，mA 甲基化修飾更多的生物學(xué)功能逐漸被發(fā)掘出來(lái)，其在組織器官發(fā)育、細(xì)胞分化、癌癥發(fā)生及脂肪生成等方面都扮演著不可或缺的角色。就現(xiàn)有研究看來(lái)，mA 相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白影響脂肪生成主要是依靠其與RNA 相結(jié)合來(lái)發(fā)揮功能，其關(guān)鍵作用意味著它們對(duì)應(yīng)的基因有望成為調(diào)節(jié)畜禽機(jī)體脂肪含量的篩選位點(diǎn)，但其中還存在著一些值得深入思考的地方：一些成脂基因在不同物種中具有序列保守性，那么這些基因發(fā)生mA 甲基化修飾產(chǎn)生的影響是否具有結(jié)果的一致性；同種動(dòng)物不同組織器官的mA 甲基化修飾水平存在差異，是否與該部位的脂肪含量呈一致性。若能通過(guò)mA 甲基化修飾水平來(lái)調(diào)控畜產(chǎn)品中的脂肪含量，將會(huì)助力畜牧生產(chǎn)向前跨進(jìn)一大步，這對(duì)于科研工作者來(lái)說(shuō)仍是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)，研究前景一片光明。