趙佩，鄒青，李澤霖

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安710038

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是由于冠狀動脈供血突然嚴重減少或中斷，使心肌嚴重急性缺血進而產(chǎn)生缺血性壞死的心血管系統(tǒng)疾病。近年來，雖然全球AMI死亡率和發(fā)病率持續(xù)下降，但后續(xù)死亡率較一般人群高30%［1］，表明AMI對人類生命安全仍具有較大威脅?；颊咴贏MI后心室形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化稱為心室重構(gòu)，表現(xiàn)為心肌梗死區(qū)域變薄，而非梗死區(qū)域心肌肥厚，使心室腔逐漸擴大，是導(dǎo)致心力衰竭的主要原因［2］，因此延遲或防止心室重構(gòu)是預(yù)防心力衰竭的關(guān)鍵。有研究者認為，中成藥在改善AMI心室重構(gòu)方面具有明顯優(yōu)勢［3-4］。黃芪甲甙主要來源于中藥黃芪生物皂苷的提取物，具有廣泛的藥理學(xué)作用，包括抗腫瘤、抗炎、抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等［5-8］。王皓等［9］發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可通過激活一氧化氮合酶信號通路，抑制炎性因子生成，對AMI模型大鼠具有保護作用，也有研究表明，黃芪甲甙可抑制心室重構(gòu)，改善心功能，降低慢性心力衰竭大鼠游離脂肪酸水平［10］。然而黃芪甲甙對AMI后心室重構(gòu)的潛在機制有待進一步闡明，因此本研究通過建立AMI大鼠模型進行黃芪甲甙處理并進一步探究其作用機制，以期為AMI的治療研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar雄性大鼠36只，SPF級，6～7周齡，體質(zhì)量226～250 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。

1.2 試劑

黃芪甲甙（純度≥98%）購于北京索萊寶公司；阿司匹林腸溶片（國藥準字H20065051）購于沈陽奧吉娜藥業(yè)有限公司；血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）、內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）大鼠酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒均購于上海江萊生物科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；Trizol購于默克公司；實時熒光定量PCR引物購于生工生物工程（上海）股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒均購于大連寶日生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模及藥物干預(yù) 造模前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機分為假手術(shù)組、模型組、黃芪甲甙低劑量組、黃芪甲甙中劑量組、黃芪甲甙高劑量組和陽性對照組共6組，每組6只。除假手術(shù)組大鼠外，其他5組大鼠按榮霞等［11］的方法建立急性心肌梗死大鼠模型，用10%水合氯醛麻醉大鼠，連接683呼吸機和SurgiVet V3404+心電圖機（中國香港友誠生物科技有限公司），結(jié)扎冠狀動脈左前降支，待左心室部分心肌變白且收縮逐漸減弱后，將心臟放回胸腔并排出胸腔氣體后縫合，心電圖出現(xiàn)Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高表示造模成功，假手術(shù)組大鼠開胸后僅分離冠狀動脈左前降支，不做結(jié)扎處理；之后逐層縫合。造模后第2天開始藥物干預(yù)：黃芪甲甙低劑量組給予20 mg·kg-1黃芪甲甙灌胃處理；黃芪甲甙中劑量組給予40 mg·kg-1黃芪甲甙灌胃處理；黃芪甲甙高劑量組給予60 mg·kg-1黃芪甲甙灌胃處理；陽性對照組給予100 mg·kg-1阿司匹林灌胃處理［12］；假手術(shù)組和模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃處理，各組大鼠均持續(xù)干預(yù)4周。末次干預(yù)1 h后，各組大鼠均進行超聲心動圖檢查和血流動力學(xué)指標檢測，再取腹主動脈血5 mL，L535-1離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）3 000 r·min-1離心15 min，收集血清，處死大鼠后取心臟，0.9%氯化鈉溶液清洗表面，取部分樣本制備單細胞懸液用于活性氧檢測，另一部分樣本液氮速凍，血清和心臟均保存于-80℃冰箱。

1.2.2 大鼠心功能檢測 比較治療第0、2、4周各組大鼠心功能變化，采用大小鼠超聲影像系統(tǒng)（玉研儀器，Sigma Vet）檢測心功能指標，包括左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fractions，LVEF）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）。檢測血流動力學(xué)指標后，迅速處死大鼠，開胸摘取心臟計算左心室質(zhì)量指數(shù)（left ventricular mass index，LVMI）。

1.2.3 血流動力學(xué)指標檢測 各組大鼠在進行末次超聲心動圖檢測后，左心室連接壓力傳感器，并用心臟血流動力學(xué)監(jiān)測系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司，型號：BL-420N）檢測血流動力參數(shù)左心室舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）和左室內(nèi)壓最大上升/下降速率（±dp/dtmax）。

1.2.4 大鼠血清AngⅡ、ET-1、BNP水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組大鼠血清AngⅡ、ET-1、BNP水平，將稀釋抗體添加至96孔板中，再加入稀釋后的血清樣品，37℃孵育1 h，加入酶標抗體，37℃孵育1 h，洗板，加入3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）底物溶液，37℃孵育30 min后終止反應(yīng)，于酶標儀上以450 nm波長讀取OD值。

1.2.5 檢測心肌組織活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量 采用酶消化法制備大鼠心肌單細胞懸液（1×106個·mL-1），用稀釋后的熒光染料重懸細胞沉淀，37℃孵育1 h后，離心收集細胞沉淀，磷酸緩沖液（phosphoric acid buffer，PBS清洗并重懸，采用930F熒光分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）檢測，激發(fā)波長為502 nm，發(fā)射波長為530 nm。

1.2.6 檢測心肌組織NADPH氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）mRNA相對表達量 采用Trizol法提取大鼠心肌組織總核糖核酸，并用紫外分光光度計確定濃度和純度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄為互補脫氧核糖核酸，并按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書配置PCR反應(yīng)體系，在PCR儀（Biorad，型號：CFX96）上進行擴增，PCR反應(yīng)程序：95℃1 min；95℃5 s，60℃30 s，循環(huán)40次；72℃延伸1 min。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算NOX和TNFα mRNA的相對表達量，所有操作均在超凈臺上進行，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.7 檢測心肌組織NOX和TNF-α蛋白表達水平將大鼠心肌組織充分勻漿、冰上裂解后提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。采用Western blot檢測心肌組織NOX和TNF-α蛋白表達水平，配置電泳凝膠，電泳至藍色染料標記到達凝膠末端，采用聚偏氟乙烯膜進行電轉(zhuǎn)，5%脫脂牛奶中封閉1.5 h，緩沖液洗膜15 min，4℃孵育一抗過夜，緩沖液洗膜15 min，室溫孵育二抗2 h，緩沖液洗膜15 min，顯色后在凝膠成像系統(tǒng)中拍攝照片，并采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，柱狀圖制作采用Graphpad Prism 6.0軟件，計量資料采用平均值±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪甲甙對急性心肌梗死大鼠心功能指標的影響

由表2可知，隨著治療時間的增加，黃芪甲苷中劑量組、黃芪甲苷高劑量組和陽性對照組LVEF、LVFS水平呈逐漸升高的趨勢（P＜0.05），但假手術(shù)組、模型組和黃芪甲苷低劑量組LVEF、LVFS水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療第0、2、4周，與假手術(shù)組比較，模型組LVEF、LVFS水平均顯著降低（P＜0.05）。治療第0周，與模型組比較，黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷中劑量組、黃芪甲苷高劑量組和陽性對照組LVEF、LVFS水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療第2周，黃芪甲苷高劑量組LVEF、LVFS水平均顯著升高（P＜0.05），黃芪甲苷低劑量組、中劑量組與陽性對照組LVEF、LVFS水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療第4周，與模型組比較，黃芪甲苷高劑量組和陽性對照組LVEF、LVFS水平均顯著升高（P＜0.05），黃芪甲苷中低劑量組LVEF、LVFS水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療第4周，與假手術(shù)組比較，模型組LVMI水平顯著升高（P＜0.05）；治療第4周，與模型組比較，黃芪甲苷中劑量組、黃芪甲苷高劑量組和陽性對照組LVMI水平均顯著降低（P＜0.05），但與黃芪甲苷低劑量組LVMI水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，黃芪甲苷能改善AMI大鼠心臟射血功能和收縮功能，減輕左心室肥厚，改善心室重構(gòu)，且高劑量改善效果最優(yōu)。

表2 黃芪甲甙對急性心肌梗死大鼠心功能指標影響（±s）Table 2 Effects of AstragalosideⅣon cardiac function indicators in rats with acute myocardial infarction(±s)

表2 黃芪甲甙對急性心肌梗死大鼠心功能指標影響（±s）Table 2 Effects of AstragalosideⅣon cardiac function indicators in rats with acute myocardial infarction(±s)

注：LVEF—左心室射血分數(shù)；LVFS—左心室短軸縮短率；LVMI—左心室質(zhì)量指數(shù)?！硎镜?周與同組治療第0周比較，差異在P＜0.05水平有統(tǒng)計學(xué)意義；△表示第4周與同組治療第2周比較，差異在P＜0.05水平有統(tǒng)計學(xué)意義；*表示與相同治療時間假手術(shù)組比較，差異在P＜0.05水平有統(tǒng)計學(xué)意義；#表示與相同治療時間模型組比較，差異在P＜0.05水平有統(tǒng)計學(xué)意義。

組別（n=6）假手術(shù)組模型組黃芪甲苷低劑量組黃芪甲苷中劑量組黃芪甲苷高劑量組陽性對照組治療時間/周0 2 4 0 2 4 0 2 4 0 2 4 0 2 4 0 2 4 LVEF/%83.48±3.22 81.54±2.41 82.96±2.21 68.52±1.48*69.85±1.29*70.17±1.30*68.73±1.32*69.81±1.14 70.68±1.65 68.48±1.40 71.65±2.13※75.42±1.79△#69.01±1.59*73.16±1.63※#79.74±1.68△#68.54±1.46 71.58±2.12※75.84±1.48△#LVFS/%35.15±4.41 34.68±3.47 35.02±3.42 23.82±3.29*23.77±3.75*23.67±2.52*23.07±2.12 26.79±2.58 27.63±2.26 23.85±2.97 30.14±3.28※#34.31±2.59△#23.94±4.13 29.55±3.51※#36.08±2.98△#23.28±2.47 29.39±2.62※#33.72±1.43△#LVMI/（g·m-2）— —92.37±6.78— —174.92±9.37*— —168.44±10.82— —108.42±9.64#— —99.28±8.21#— —112.69±9.26#

2.2 黃芪甲甙對急性心肌梗死大鼠血流動力學(xué)指標的影響

由圖1可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血流動力學(xué)指標LVSP、±dp/dt均顯著降低（P＜0.05），LVEDP顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷中劑量組、黃芪甲苷高劑量組和陽性對照組LVSP、±dp/dt均顯著升高（P＜0.05），LVEDP顯著降低（P＜0.05），但與黃芪甲苷低劑量組LVSP、LVEDP、±dp/dt差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，黃芪甲苷可增強AMI大鼠心室的收縮和舒張功能，改善血流動力學(xué)指標，中、高劑量均有較好的療效。

圖1 黃芪甲甙對急性心肌梗死大鼠血流動力學(xué)指標的影響Fig.1 Effects of AstragalosideⅣon hemodynamic indicators in rats with acute myocardial infarction

2.3 黃芪甲甙對急性心肌梗死大鼠血清AngⅡ、ET-1、BNP水平的影響

由圖2可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清AngII、ET-1、BNP均升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷中劑量組、黃芪甲苷高劑量組和陽性對照組血清AngII、ET-1、BNP均降低（P＜0.05），黃芪甲苷低劑量組變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果說明，黃芪甲苷可通過降低血清AngII、ET-1和BNP水平，促進血管收縮，進而增加回心血量，減少心室負荷，抑制AMI后代償性心室重構(gòu)，高劑量效果最優(yōu)。

圖2 黃芪甲甙對急性心肌梗死大鼠血清AngⅡ、ET-1、BNP水平的影響Fig.2 Effects of AstragalosideⅣon levels of serum AngⅡ,ET-1 and BNP in rats with acute myocardial infarction

2.4 黃芪甲甙對急性心肌梗死大鼠心肌組織ROS含量的影響

由圖3可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織ROS含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷中劑量組、黃芪甲苷高劑量組和陽性對照組心肌組織ROS含量顯著降低（P＜0.05），但與黃芪甲苷低劑量組的ROS含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果說明，中、高劑量的黃芪甲苷能降低AMI大鼠心肌組織ROS含量，從而減少因ROS過多引起的氧化應(yīng)激及其對下游靶標的損傷。

圖3 黃芪甲甙對急性心肌梗死大鼠心肌組織ROS含量的影響Fig.3 Effects of AstragalosideⅣon ROS content in myocardial tissue of rats with acute myocardial infarction

2.5 黃芪甲甙對急性心肌梗死大鼠心肌組織NOX、TNF-α表達的影響

由圖4可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織NOX、TNF-α mRNA相對表達量和蛋白表達水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷中劑量組、黃芪甲苷高劑量組和陽性對照組心肌組織NOX、TNF-α mRNA相對表達量和蛋白表達水平均降低（P＜0.05），但與黃芪甲苷低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明黃芪甲苷可抑制AMI大鼠心肌NOX、TNF-α表達。

圖4 黃芪甲甙對急性心肌梗死大鼠心肌組織NOX、TNF-α基因和蛋白表達水平的影響Fig.4 Effects of AstragalosideⅣon gene and protein expression levels of NOX and TNF-α in myocardial tissue of rats with acute myocardial infarction

3 討論

AMI臨床表現(xiàn)為心前區(qū)或胸骨后的壓榨性疼痛，可伴有惡心、嘔吐、呼吸困難等癥狀［13］，嚴重影響患者的生存期和生活質(zhì)量。心室重構(gòu)是AMI重要病理特征，包括心室壁增厚、心室擴張和膠原纖維增生，導(dǎo)致心功能障礙、耗氧量增加，嚴重時甚至?xí)l(fā)心源性死亡［14］。因此抑制心室重構(gòu)是治療AMI的關(guān)鍵步驟。目前對AMI引起的心室重構(gòu)作用機制尚不明確，通過建立AMI模型大鼠對其進行進一步研究具有重要的臨床意義。

黃芪具有補氣升陽、固表止汗、生津養(yǎng)血、行滯通痹等作用［15］；同時黃芪制劑對心臟有保護作用，包括促進心臟微血管形成、改善心肌細胞肥大、抑制心肌細胞凋亡和炎癥損傷、減輕氧化應(yīng)激、改善能量代謝紊亂等［16］，黃芪甲甙作為黃芪的重要活性成分也具有相似的作用［17］。本研究結(jié)果表明，黃芪甲苷中劑量組、黃芪甲苷高劑量組和陽性對照組AMI大鼠心功能指標LVEF、LVFS隨治療時間的增加不斷改善，且改善程度均優(yōu)于模型組，同時LVMI和血流動力學(xué)指標LVSP、LVEDP、±dp/dt均有顯著改善，表明黃芪甲甙可改善AMI大鼠心室收縮功能和左心室肥厚狀態(tài)，抑制AMI后心室重構(gòu)，可能與黃芪甲苷抑制炎癥反應(yīng)和改善心肌細胞肥大的作用相關(guān)。

AngⅡ、ET-1、BNP水平與心室重構(gòu)密切相關(guān)。AngII可加重心臟纖維化，誘導(dǎo)心室重構(gòu)，同時伴隨氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)［18］。ET-1是心血管最主要的血管收縮劑，參與內(nèi)皮功能障礙和炎癥的發(fā)生發(fā)展，以及血管重塑過程，心肌組織中ET水平上調(diào)會導(dǎo)致心肌纖維化以及心室收縮和舒張功能障礙，且內(nèi)皮素拮抗劑可改善心肌纖維化和心室重構(gòu)［19-20］。研究表明，連續(xù)3個月BNP水平下降率是左心室重構(gòu)的重要獨立預(yù)測因子［21］。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)中、高劑量黃芪甲甙干預(yù)后，AMI大鼠血清AngⅡ、ET-1、BNP水平均降低，佐證了黃芪甲甙對AMI后心室重構(gòu)的抑制作用。

NOX是ROS的主要來源之一，Zhang等［22］發(fā)現(xiàn)AngⅡ可以激活NOX，增加其蛋白質(zhì)表達和催化活性，促進ROS的產(chǎn)生。ROS通過多種途徑導(dǎo)致細胞損傷，包括促炎信號通路的激活、抗氧化劑和信號分子的消耗以及大分子的氧化［23］。TNF-α可能是心臟損傷、炎癥和細胞凋亡發(fā)病機制中的重要細胞因子，通過激活TNF受體介導(dǎo)的多種信號分子誘導(dǎo)多種炎癥基因表達［24］。研究表明，腦心通膠囊可通過肝X受體α抑制NOX/ROS/TNF-α信號傳導(dǎo)通路改善AMI后心室重構(gòu)［25］，與本研究結(jié)果基本一致，說明黃芪甲苷對AMI的治療作用可能與調(diào)控NOX/ROS/TNF-α信號通路相關(guān)。

綜上所述，黃芪甲甙對AMI大鼠心功能及血流動力學(xué)有明顯改善效果，且可降低其血清AngⅡ、ET-1、BNP水平，抑制心室重構(gòu)，可能與下調(diào)NOX/ROS/TNF-α信號通路表達有關(guān)，但具體作用機制還需后續(xù)實驗進一步研究。