徐奔，覃銳，向航，許京淑，廖子龍，向金平

恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院血液科，湖北 恩施445000

急性骨髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種髓性白細(xì)胞異常增殖的血液腫瘤，具有高度異質(zhì)性，死亡率較高。目前，臨床治療AML多采用化療、干細(xì)胞移植等方法，雖然可以一定程度上緩解疾病進(jìn)程，但AML易復(fù)發(fā)、患者預(yù)后差等問(wèn)題仍然是影響患者生命安全和生活質(zhì)量的關(guān)鍵［1-2］。因此，在臨床上需要深入探究AML的發(fā)病機(jī)制以尋找更有效的低毒藥物和潛在靶點(diǎn)，改善患者預(yù)后，降低死亡率。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及細(xì)胞基因組學(xué)的改變，微小RNA（microRNA，miR）作為一種非蛋白編碼單鏈RNA，可通過(guò)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控介導(dǎo)基因的表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞基因組學(xué)改變過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［3-4］。miR-449a是miR-449家族的一員，其在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，能夠調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)基因表達(dá)，被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子［5-7］。已有研究證實(shí)［8］，miR-449a能夠調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生物學(xué)過(guò)程，miR-449a在A(yíng)ML發(fā)病、治療中可能發(fā)揮著重要作用。臭椿酮（ailanthone，AIL）是從傳統(tǒng)藥用植物臭椿中提取的具有抗腫瘤、抗炎、抗瘧疾、抗過(guò)敏等生物活性的單體化合物。有文獻(xiàn)報(bào)道［9］，AIL對(duì)乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，然而，AIL對(duì)AML細(xì)胞的作用效果尚未完全明確。本研究旨在揭示AIL對(duì)AML細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，并分析其作用機(jī)制是否與調(diào)控miR-449a相關(guān)，以期為AML的治療研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人AML系HL-60細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；AIL（純度＞98%，瑞芬思生物科技有限公司）；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（日本同仁化學(xué)研究所）；Matrigel基質(zhì)膠（上海尚善生物科技有限公司）；Transwell小室（美國(guó)Millipore公司）；RNA提取試劑盒與反轉(zhuǎn)錄試劑盒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；miR-449a mimic質(zhì)粒、mimic對(duì)照質(zhì)粒、miR-449a inhibitor質(zhì)粒、inhibitor對(duì)照質(zhì)粒（廣州銳博生物科技有限公司）；兔抗磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）、磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、蛋 白 激 酶B（protein kinase B，AKT）、磷酸化AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）單克隆抗體、鼠抗β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）和HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（H+L）（美國(guó)Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HL-60細(xì)胞株置于RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素）中，在37℃，5 % CO2的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，細(xì)胞每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 用不同濃度（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol·L-1）的AIL處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞24 h，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況以篩選AIL適宜濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。將miR-449a mimic質(zhì)粒、mimic對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至未經(jīng)任何處理的HL-60細(xì)胞中，分別記為miR-449a mimic組、mimic NC組；將miR-449a inhibitor質(zhì)粒、inhibitor對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至未經(jīng)任何處理的HL-60細(xì)胞，并用適宜濃度的AIL處理細(xì)胞24 h，記為AIL+miR-449a inhibitor組、AIL+inhibitor NC組，以未經(jīng)任何處理的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組（Control組）。轉(zhuǎn)染過(guò)程嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞，以5×104cell·mL-1濃度接種于96孔板貼壁培養(yǎng)，用不同終濃度（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol·L-1）AIL處理細(xì)胞，同時(shí)按照1.2.2的方法設(shè)置分組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，于37℃條件下培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定每個(gè)孔的吸光度（OD450）值，按公式（1）計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將經(jīng)過(guò)相應(yīng)處理的HL-60細(xì)胞以1×106cell·mL-1濃度接種于6孔板培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，用200 μL移液器槍頭垂直劃線(xiàn)，分別干預(yù)0和24 h后在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞遷移情況，按公式（2）計(jì)算細(xì)胞遷移率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 預(yù)先用Matrigel基質(zhì)膠活化Transwell小室1 h。收集經(jīng)過(guò)處理的HL-60細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋為5×108cel·lmL-1的細(xì)胞懸液，Transwell小室上室加入400 μL細(xì)胞懸液，下室加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基600 μL，Transwell小室在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，用無(wú)菌棉簽輕輕擦去上室未侵襲細(xì)胞，用甲醇固定，0.1 %結(jié)晶紫染色5 min，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞侵襲數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將經(jīng)過(guò)處理的HL-60細(xì)胞以5×105cell·mL-1濃度接種于6孔板培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，用500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入5 μL Annexin V-FITC染液和5 μL PI染液，室溫下暗室孵育15 min。在流失細(xì)胞儀上分析細(xì)胞凋亡情況，按公式（3）計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%(3)

1.2.7 qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR-449a mRNA表達(dá)水平 收集處理過(guò)的HL-60細(xì)胞懸液，加入Trizol試劑提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度和濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)qRT-PCR熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系，進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。引物 序 列 為：miR-449a上 游 引 物：5′-CTCGCTGGCAGTGTATTGTTAG-3′，下游引物：5′-TATCGTTGTACTCCAGACCAAGAC-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 引 物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。循環(huán)條件為：95℃30 s，60℃30 s；72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參基因，相對(duì)表達(dá)量采用2－△△Ct法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 Western blot法 檢測(cè)PI3K/AKT信 號(hào) 通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 收集處理過(guò)的HL-60細(xì)胞懸液，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品用SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，室溫下在含0.5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉2 h，TBST洗膜3次，加入PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT一抗（1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，加入對(duì)應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗（1∶2 000），室溫下孵育2 h，加入ECL試劑顯影，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，滿(mǎn)足正態(tài)性且組間方差齊，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較組間差異性，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 AIL對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示（圖1），與Control組比較，不同濃度AIL處理HL-60細(xì)胞24 h后，細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高（P＜0.05），且隨著AIL濃度增加，細(xì)胞增殖抑制率呈濃度依賴(lài)性增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AIL處理HL-60細(xì)胞24 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（0.78±0.06）μmol·L-1，基于此，本研究后續(xù)細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡實(shí)驗(yàn)選擇0.6、0.8、1.0 μmol·L-1作為AIL處理HL-60細(xì)胞的濃度。

圖1 AIL對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響視圖Fig.1 Effect of AIL on proliferation of HL-60 cells

2.2 AIL對(duì)HL-60細(xì)胞遷移、侵襲能力和凋亡的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2A），與Control組比較，0.6、0.8、1.0 μmol·L-1AIL組HL-60細(xì)胞遷移率均顯著降低（P＜0.05）。Transwell小室法結(jié)果顯示（圖2B），與Control組比較，0.6、0.8、1.0 μmol·L-1AIL組HL-60細(xì)胞侵襲數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。流失細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示（圖2C），與Control組比較，0.6、0.8、1.0 μmol·L-1AIL組HL-60細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。上述結(jié)果提示AIL抑制HL-60細(xì)胞遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。鑒于A(yíng)IL對(duì)HL-60細(xì)胞生物學(xué)行為的作用隨濃度增大而增強(qiáng)，因此，本研究選擇1.0 μmol·L-1的AIL濃度作為轉(zhuǎn)染后HL-60細(xì)胞的作用濃度。

圖2 AIL對(duì)HL-60細(xì)胞遷移、侵襲能力和凋亡的影響Fig.2 Effects of AIL on migration,invasion and apoptosis of HL-60 cells

2.3 AIL對(duì)HL-60細(xì)胞miR-449a mRNA表達(dá)水平的影響

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示（圖3），與Control組比 較，0.6、0.8、1.0 μmol·L-1AIL組HL-60細(xì) 胞miR-449a mRNA表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果表明AIL能夠上調(diào)HL-60細(xì)胞miR-449a的表達(dá)。

圖3 AIL對(duì)HL-60細(xì)胞miR-449a mRNA表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of AIL on miR-449a mRNA expression in HL-60 cells

2.4 過(guò)表達(dá)miR-449a對(duì)HL-60細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示（圖4A），與Control組比較，mimic NC組HL-60細(xì)胞中miR-449a mRNA表達(dá)量無(wú)顯著性變化（P＞0.05）；與mimic NC組比較，miR-449a mimic組HL-60細(xì) 胞 中miR-449amRNA表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。提示轉(zhuǎn)染效果良好。CCK-8實(shí)驗(yàn)（圖4B）、劃痕實(shí)驗(yàn)（圖4C）、Transwell小室法（圖4D）及流失細(xì)胞術(shù)（圖4E）結(jié)果顯示，mimic NC組HL-60細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、遷移率及侵襲數(shù)目與Control組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與mimic NC組比較，miR-449a mimic組HL-60細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率均顯著升高，遷移率及侵襲數(shù)目均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果提示過(guò)表達(dá)miR-449a抑制HL-60細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖4 過(guò)表達(dá)miR-449a對(duì)HL-60細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響Fig.4 Effects of overexpression of miR-449a on proliferation,apoptosis,migration and invasion of HL-60 cells

2.5 抑制miR-449a表達(dá)逆轉(zhuǎn)AIL對(duì)HL-60細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示（圖5A），與Control組比較，AIL組HL-60細(xì)胞中miR-449a mRNA表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；AIL+inhibitor NC組HL-60細(xì)胞中miR-449a mRNA表達(dá)量與AIL組細(xì)胞miR-449a mRNA表達(dá)水平相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與AIL+inhibitor NC組比較，AIL+miR-449a inhibitor組HL-60細(xì) 胞 中miR-449a mRNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果提示轉(zhuǎn)染效果良好。CCK-8實(shí)驗(yàn)（圖5B）、劃痕實(shí)驗(yàn)（圖5C）、Transwell小室法（圖5D）及流失細(xì)胞術(shù)（圖5E）結(jié)果顯示，與Control組比較，AIL組HL-60細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率均顯著升高，遷移率及侵襲數(shù)目均顯著降低（P＜0.05）；AIL+inhibitor NC組HL-60細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、遷移率及侵襲數(shù)目與AIL組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與AIL+inhibitor NC組比較，AIL+miR-449a inhibitor組HL-60細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率均顯著降低，遷移率及侵襲數(shù)目均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果提示抑制miR-449a表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)AIL抑制HL-60細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及誘導(dǎo)凋亡的作用。

圖5 抑制miR-449a表達(dá)逆轉(zhuǎn)AIL對(duì)HL-60細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響Fig.5 Effects of inhibition expression of miR-449a reverses the effects of AIL on proliferation,apoptosis,migration and invasion of HL-60 cells

2.6 抑制miR-449a表達(dá)逆轉(zhuǎn)AIL對(duì)HL-60細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示（圖6），與Control組 比較，AIL組HL-60細(xì) 胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值均顯著降低（P＜0.05）；AIL+inhibitor NC組HL-60細(xì)胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值與AIL組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與AIL+inhibitor NC組比較，AIL+miR-449a inhibitor組HL-60細(xì) 胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值均顯著升高（P＜0.05）。提示抑制miR-449a表達(dá)逆轉(zhuǎn)AIL抑制HL-60細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路的作用。

圖6 抑制miR-449a表達(dá)逆轉(zhuǎn)AIL對(duì)HL-60細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.6 Effects of inhibition expression of miR-449a reverses the regulatory effect of AIL on the expression of PI3K/Akt signaling pathway related proteins in HL-60 cells

3 討論

AML是血液系統(tǒng)患者死亡的主要原因之一，近年來(lái)，針對(duì)AML的治療已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但仍無(wú)法徹底根治該疾病，因此，明確AML的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療策略勢(shì)在必行［10］。現(xiàn)代中醫(yī)藥研究證實(shí)，中藥活性成分提取物在惡性腫瘤的防治中具有多靶點(diǎn)作用、毒性小等優(yōu)勢(shì)［11］。AIL是一種來(lái)源于中草藥臭椿的天然活性化合物，大量研究表明AIL可通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。肝癌細(xì)胞中AIL可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡阻止細(xì)胞生長(zhǎng)［12］；黑色素瘤細(xì)胞中AIL通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路和線(xiàn)粒體介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路分別誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡［13］；研究還發(fā)現(xiàn)，AIL通過(guò)上調(diào)miR-148a表達(dá)及抑制AMPK和Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［14］；AIL通過(guò)下調(diào)miR-21和阻斷Ras/Raf/MEK/ERK及mTOR途徑抑制人前庭神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬［15］。上述研究結(jié)果表明，AIL可通過(guò)介導(dǎo)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和基因靶點(diǎn)調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期阻滯、凋亡和自噬。本研究以不同濃度AIL處理白血病HL-60細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，AIL對(duì)HL-60細(xì)胞具有增殖抑制作用，且增殖抑制作用隨AIL濃度增加而增強(qiáng)。本研究進(jìn)一步檢測(cè)AIL對(duì)HL-60細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)AIL能夠顯著抑制HL-60細(xì)胞遷移、侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，說(shuō)明AIL具有顯著的抗AML活性。

人體內(nèi)多種miR表達(dá)異常和腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［16］。miR-449家族分布于5號(hào)染色體細(xì)胞分裂周期基因20B（cell division cycle gene 20B，CDC20B）的第二個(gè)內(nèi)含子上，該區(qū)域（5q11.2）是癌癥的強(qiáng)易感性位點(diǎn)，人體miR-449表達(dá)異常可能引起腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。miR-449a是miR-449家族的一員，在腫瘤生長(zhǎng)、增殖以及分化中發(fā)揮著重要作用。相關(guān)研究指出，miR-449a可抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，并通過(guò)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡和分化［17］。miR-449a在骨肉瘤中表達(dá)下調(diào)，并通過(guò)調(diào)控B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（BCL2）促進(jìn)細(xì)胞凋亡［18］。肝癌中miR-449a通過(guò)下調(diào)Calpain 6和POU2F1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡［19］。非 小 細(xì) 胞 肺 癌 中miR-449a通 過(guò) 靶 向HMGB1介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲［20］。本研究中，不同濃度AIL處理HL-60細(xì)胞后，細(xì)胞中miR-449a mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，說(shuō)明AIL對(duì)HL-60細(xì)胞中miR-449a表達(dá)具有促進(jìn)作用。進(jìn)一步調(diào)控miR-449a表達(dá)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-449a可抑制HL-60細(xì)胞增殖、遷移、侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而抑制miR-449a表達(dá)可減弱AIL抑制HL-60細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，提示AIL可能是通過(guò)上調(diào)miR-449a表達(dá)發(fā)揮抑制HL-60細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。與Zhang等［21］研究結(jié)果一致，AIL上調(diào)miR-449a抑制急性骨髓性白血病的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。

PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)參與細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成等過(guò)程的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。已有研究證實(shí)［22］，PI3K/AKT信號(hào)通路是miR-449a下游信號(hào)通路之一，miR-449a可通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞生物學(xué)行為中發(fā)揮重要調(diào)控作用。同時(shí)，PI3K/AKT信號(hào)通路的激活與AML的發(fā)生具有密切相關(guān)性［23］。本研究檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白發(fā)現(xiàn)，AIL作用于HL-60細(xì)胞后PI3K/AKT信號(hào)通路中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值降低，表明AIL抑制HL-60細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路活化，而抑制miR-449a表達(dá)逆轉(zhuǎn)AIL對(duì)HL-60細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制作用。這提示，AIL抑制HL-60細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和誘導(dǎo)凋亡的作用可能與調(diào)控miR-449a表達(dá)、抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活化有關(guān)。

綜上所述，本研究證實(shí)AIL通過(guò)上調(diào)HL-60細(xì)胞中miR-449a的表達(dá)發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路的活化有關(guān)。本研究為治療AML提供了可選藥物和潛在治療靶點(diǎn)。但本研究實(shí)驗(yàn)內(nèi)容有限，AIL對(duì)AML的抗癌作用仍需在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。