袁楊秀，鐘英，周云峰

1.袁州區(qū)婦幼保健院，江西 宜春 336000；2.宜春市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江西 宜春 336000

橘紅顆粒是由化橘紅、陳皮、法半夏、浙貝母等15 種藥味組成的中藥復(fù)方制劑［1］，主治胸悶口干、痰多、痰熱咳嗽、色黃黏稠等癥［2］，乃臨床上用于清肺、化痰、止咳的重要良藥。橘紅顆粒方中浙貝母為佐藥，具有清熱化痰止咳的功效［3-5］。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)［1］只對(duì)該制劑中的浙貝母進(jìn)行了定性鑒別，但在無法知悉其真實(shí)投料的情況下，難以甄別少投料、摻偽等行為，因此有必要對(duì)其含量進(jìn)行分析。鑒于橘紅顆粒的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)無浙貝母的含量測(cè)定項(xiàng)，本研究對(duì)橘紅顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提升，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）建立浙貝母藥味中貝母素甲和貝母素乙的含量測(cè)定方法，報(bào)告如下。

1 儀器與材料

沃特世H-class 超高效液相系統(tǒng)（美國waters公司）；沃特世xevo TQD 三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜系統(tǒng)（美國waters 公司）；KH-250DB 超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；Molelement1820D 純水機(jī)（重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司）。

橘紅顆粒樣品（市售10 批，來源于8 個(gè)廠家，規(guī)格均為11 g/袋，其他信息見表2）；貝母素甲對(duì)照品（批號(hào)：110750-201913，純度：98.4%）和貝母素乙對(duì)照品（批號(hào)：110751-201712，純度：97.7%）購于中國食品藥品檢定研究院；缺浙貝母的陰性樣品（自制）；乙腈、甲醇和甲酸為色譜純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜、質(zhì)譜條件

超高效液相系統(tǒng)：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC ? BEH C18 柱；柱溫25 ℃；以0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，流速0.3 mL/min，梯度洗脫（0～2 min，10%B；2～10 min，10%→45%B；10～14 min，45%→75%B；14～15 min，75%→10%B；15～18 min，10%B）；進(jìn)樣量5 μL。三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜系統(tǒng)：電噴霧離子源ESI；正離子電離模式（+）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；霧化氣流量900 L/h；錐孔氣流量50 L/h；干燥氣溫度550 ℃；毛細(xì)管電壓0.70 kv；貝母素甲檢測(cè)離子對(duì)m/z432.0 →414.0（定量），m/z432.0 →98.0；貝母素乙檢測(cè)離子對(duì)m/z430.2 →412.3（定量），m/z430.2 →98.0。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取貝母素甲、貝母素乙對(duì)照品適量，加甲醇溶解配成含貝母素甲183.811 2 ng/mL、貝母素乙224.905 4 ng/mL 的對(duì)照品混合母液。

2.3 供試品溶液的制備

取裝量差異項(xiàng)下的樣品，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置于100 mL 量瓶中，加入80 mL 0.1%氨水的80%甲醇溶液，超聲處理20 min，放至室溫，用0.1%氨水的80%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品混合母液適量，加甲醇稀釋配制成含貝母素甲3.676 2 ng/mL、9.190 6 ng/mL、18.381 1 ng/mL、27.571 7 ng/mL、36.762 2 ng/mL、91.905 6 ng/mL、183.811 2 ng/mL 和貝母素乙4.498 1 ng/mL、11.245 3 ng/mL、22.490 5 ng/mL、33.735 8 ng/mL、44.981 1 ng/mL、112.452 7 ng/mL、224.905 4 ng/mL 一系列濃度的對(duì)照品溶液，按照2.1 項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件，測(cè)定不同濃度對(duì)照品的峰面積。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出貝母素甲的回歸方程為Y=3 659.9X-2 409.8，r=0.999 9；貝母素乙的回歸方程為Y=8 448.9X+55 588，r=0.993 3。

2.5 專屬性試驗(yàn)

為驗(yàn)證其他藥味對(duì)浙貝母含量測(cè)定無干擾，以缺浙貝母藥味的實(shí)驗(yàn)室自制橘紅顆粒按“2.3”項(xiàng)下處理方法制備陰性樣品溶液，與供試品溶液、對(duì)照品溶液依次進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果可知，供試品溶液檢出與貝母素甲和貝母素乙對(duì)照品溶液保留時(shí)間一致的離子峰，而陰性樣品溶液在與對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間上未出現(xiàn)離子峰，說明制劑中其他藥味對(duì)該含量測(cè)定無干擾，方法的專屬性較好，見圖1。

2.6 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)

取一份混合對(duì)照品溶液（貝母素甲濃度為18.381 1 ng/mL，貝母素乙濃度為22.490 5 ng/mL），連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，貝母素甲和貝母素乙的峰面積RSD 分別為2.0%和0.6%；平行稱取6 份樣品（批號(hào)：20210305），制備供試品溶液，測(cè)定含量，貝母素甲和貝母素乙的RSD 為2.5%和1.5%；取重復(fù)性項(xiàng)下的一份供試品溶液，在0 h、2 h、4 h、8 h、16 h 測(cè)定峰面積，貝母素甲和貝母素乙的RSD 分別為2.6%和1.4%。說明該方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

稱取6 份樣品（批號(hào)：20210305），每份約0.5 g，精密稱定，置于100 mL 量瓶中，精密加入混合對(duì)照品溶液10 mL（貝母素甲濃度為0.137 9 μg/mL，貝母素乙濃度為1.124 5 μg/mL），再加入0.1%氨水的80%甲醇溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備加標(biāo)樣品溶液，依次測(cè)定，回收率見表1。

表1 加標(biāo)回收率

2.8 樣品結(jié)果

取不同廠家不同批號(hào)的樣品，分別按照“2.3”下方法制備供試品溶液，按上述色譜、質(zhì)譜條件測(cè)定峰面積，代入回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 橘紅顆粒中貝母素甲和貝母素乙含量結(jié)果（n=2）

3 討論

貝母素甲和貝母素乙為甾體類生物堿［6-7］，在紫外光區(qū)無吸收［8］，其含量一般采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法進(jìn)行分析［1,9-12］。但考慮到該法靈敏度較低，樣品前處理較為煩瑣，且橘紅顆粒中浙貝母投料占比較低，本研究采用UPLC-MS/MS 法測(cè)定橘紅顆粒中貝母素甲和貝母素乙的含量。液相系統(tǒng)選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相，貝母素甲和貝母素乙采用等度洗脫其離子峰會(huì)互相干擾，后采用梯度洗脫程序，二者可在色譜柱中有效分離；質(zhì)譜系統(tǒng)選擇電噴霧離子源、正離子電離和MRM采集模式，在該條件下貝母素甲和貝母素乙均具有較高的信號(hào)響應(yīng)。

貝母素甲定量檢測(cè)離子對(duì)為m/z432.0 →414.0，貝母素乙定量檢測(cè)離子對(duì)為m/z430.2 →412.3，其裂解規(guī)律為在正離子電離模式下，貝母素甲的母離子為m/z432.0［M+H］+，失去一分子H2O 得到子離子m/z414.0［M+H-H2O］+；貝母素乙的母離子為m/z430.2［M+H］+，失去一分子H2O 產(chǎn)生子離子m/z412.3［M+H-H2O］+。

貝母素甲和貝母素乙可溶于甲醇中［13］，但在植物或中藥制劑中一般以鹽的形式存在，采用甲醇直接提取橘紅顆粒中的上述兩種成分可能不能完全提取或需要較長(zhǎng)時(shí)間，而加入一定量的氨水后可使其轉(zhuǎn)為游離態(tài)［14］，有利于溶于有機(jī)試劑。考慮到顆粒制劑一般在水中能快速溶散溶解，樣品提取溶劑最終選擇0.1%氨水的80%甲醇溶液，經(jīng)過超聲20 min 后，貝母素甲和貝母素乙即可提取完全。

從橘紅顆粒中貝母素甲和貝母素乙含量結(jié)果來看，不同生產(chǎn)企業(yè)的樣品含量差異明顯，其中貝母素乙最高量約為最低量的23 倍。分析原因可能是與浙貝母原料進(jìn)貨來源、采收季節(jié)、種植區(qū)域等不同有關(guān)，但也不排除企業(yè)對(duì)浙貝母質(zhì)量控制把關(guān)不嚴(yán)甚至為了牟利出現(xiàn)少投料、藥渣投料或摻偽等情況。

綜上所述，所建立的UPLC-MS/MS 法能夠快速準(zhǔn)確測(cè)定橘紅顆粒中貝母素甲和貝母素乙的含量，有助于控制該品種的質(zhì)量，對(duì)于保障該品種用藥安全有效性具有一定作用。