唐慶，王然，楊德泉，丁野

1.湘西土家族苗族自治州食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 吉首 416000；2.湖南省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410001

山藥為薯蕷科植物薯蕷的干燥根莖，是中醫(yī)臨床常用的健脾補(bǔ)氣中藥，也是食藥兩用植物。山藥中含有尿囊素、熊果苷、黏液蛋白、香草醇、煙酰胺、L-色氨酸、淀粉、苯丙氨酸等成分，尿囊素是重要有效成分之一［1-2］。尿囊素具有抗?jié)儭⒖寡住⒓涌靷谟?、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、軟化角質(zhì)蛋白、保護(hù)腎細(xì)胞、保護(hù)心肌細(xì)胞等作用［3-6］。清·凌奐《本草害利》［7］載“土炒”方法，主張“入脾胃土炒”，土炒山藥炮制是取凈山藥片用灶心土炒至表面均勻掛土粉，凈山藥經(jīng)土炒后增強(qiáng)補(bǔ)脾止瀉之功效?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2020 年版一部山藥項(xiàng)下收載了山藥片及麩炒山藥兩種飲片，該標(biāo)準(zhǔn)中，鑒別（1）為顯微鑒別，鑒別（2）為薄層色譜法，未收載含量測(cè)定項(xiàng)目。《湖南省中藥飲片炮制規(guī)范》2010 年版收載有山藥、麩炒山藥、土炒山藥三種飲片［8］，但均未建立薄層色譜鑒別及含量測(cè)定方法。本研究為完善土炒山藥飲片標(biāo)準(zhǔn)，參考有關(guān)文獻(xiàn)［9-13］，建立了土炒山藥飲片中薄層色譜鑒別和尿囊素高效液相色譜含量測(cè)定方法。

1 儀器、試藥和樣品

1.1 儀器

瑞士梅特勒-托利多公司AB135-S 型電子天平；北京光明DZF 型真空干燥箱 ；昆山美美公司KQ-200B 型超聲儀（功率300 w，40 kHz）；日本shimdzu 公司UV-2700 紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)；日本shimdzu 公司LC-20AT 高效液相色譜儀及SPD-M20A 檢測(cè)器；美國(guó)Agilent 公司1260 infinity Ⅱ高效液相色譜儀及DAD-G7115A 檢測(cè)器；湖南平凡TG16-Ⅱ型醫(yī)用離心機(jī)（功率0.7 kW）。

1.2 試藥和樣品

山藥對(duì)照藥材（批號(hào)121137-201807），尿囊素對(duì)照品（批號(hào)111501-200202，含量：100%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。10 cm×20 cm 硅膠G 薄層板（默克公司）；美國(guó)TEDIA 公司色譜純甲醇；中沃制水機(jī)制備的超純化水;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。8 批土炒山藥樣品見(jiàn)表1。

表1 土炒山藥飲片來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

分別取T1～T8 樣品粉末（過(guò)2 號(hào)篩）4 g，按《中國(guó)藥典》2020 年版一部山藥項(xiàng)下薄層色譜法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 土炒山藥薄層色譜

8 批供試品薄層色譜圖中顯示的熒光斑點(diǎn)與山藥對(duì)照藥材顯示的熒光斑點(diǎn)顏色與位置一致；斑點(diǎn)清晰分離較好。

2.2 高效液相含量測(cè)定及方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件 色譜柱：YMC HPLC Column C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)為224 nm；柱溫35 ℃；流速：0.4 mL/min；流動(dòng)相；甲醇-磷酸二氫鉀緩沖溶液（取超純化水約1 800 mL 加磷酸二氫鉀6.8 g 攪拌使溶解，用磷酸調(diào)pH4.0，傾入2 000 mL容量瓶中，加超純化水至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾）（1∶99）；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取尿囊素對(duì)照品（真空干燥箱P2O5減壓干燥12 h 以上）適量，加20%乙醇溶液（以下簡(jiǎn)稱溶劑）制成濃度為87.480 μg/mL 尿囊素對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取過(guò)三號(hào)篩的土炒山藥樣品粉末約0.55 g，精密稱定，置于100 mL 具塞錐形瓶中，精密加溶劑25 mL，稱重，放置在有冰袋的超聲儀中超聲處理30 min，放冷，震蕩10 min,再稱重，用溶劑補(bǔ)重，搖勻，傾入50 mL 具塞離心管中離心10 min（4 000 r/min），靜置，上清液過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.4 專屬性與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 按上述色譜條件（下同）取20% 乙醇溶液（溶劑空白）、對(duì)照品溶液及供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 中空白溶劑無(wú)干擾，尿囊素對(duì)照品保留時(shí)間為8.086 min，土炒山藥供試品溶液尿囊素保留時(shí)間為8.081 min，與對(duì)照品溶液中尿囊素保留時(shí)間一致，其他成分與尿囊素的分離較好，基線平穩(wěn)，專屬性好。尿囊素與相鄰色譜峰分離度（R）分別為7.80、1.93 達(dá)到有效分離，尿囊素峰理論板數(shù)為25 065，峰形尖銳對(duì)稱，理論板數(shù)、分離度等符合要求。

圖2 HPLC色譜圖：A.溶劑；B.尿囊素對(duì)照品溶液；C.供試品溶液

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取尿囊素對(duì)照品（真空干燥箱P2O5減壓干燥12 h 以上,含量以100%計(jì)）21.87 mg，加溶劑制成濃度為437.40 μg/mL 對(duì)照品貯備溶液，精密量取貯備溶液適量加20%的乙醇溶液依次稀釋為含尿囊素濃度437.40、218.70、109.35、87.48、54.675、27.338、2.733 8 μg/mL 對(duì)照品溶液。分別取10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，濃度為（μg/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，尿囊素回歸方程為y=6.768 9x+8.299 4，r=1.000 0；結(jié)果表明尿囊素在2.733 8～437.40 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批土炒山藥樣品（批號(hào)2019101512）制備一份供試品溶液（按上述供試品溶液制備方法，下同），在制備后0、3、6、9、12、24 h，分別取10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)尿囊素峰面積值，RSD=0.28%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取穩(wěn)定性試驗(yàn)項(xiàng)下的供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)尿囊素峰面積值，RSD=0.54%，數(shù)據(jù)說(shuō)明精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批土炒山藥樣品（批號(hào)2019101512）6 份，配成6 份供試品溶液分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果（按干燥品計(jì)算）見(jiàn)表2，可知方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 耐用性試驗(yàn) 為確保方法的可靠性，測(cè)定條件小的變動(dòng)測(cè)定結(jié)果不受影響，本研究采用不同高效液相色譜儀和不同品牌的色譜柱考察本方法色譜系統(tǒng)的耐用性。分別用設(shè)備（1）儀器LC-20AT，色譜柱ZORBAX SB-Aq C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，編號(hào)USAG019558，Agilent 公 司）；設(shè)備（2）儀器Agilent 1260 Ⅱ，色譜柱YMC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，編 號(hào)HS12S05-2546WT，YMC 公 司）按“2.2.1”色譜條件平行測(cè)定3 份土炒山藥供試品溶液中尿囊素峰面積，結(jié)果見(jiàn)表3，試驗(yàn)表明本方法耐用性良好。

表3 不同設(shè)備下含量測(cè)定 %

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批號(hào)（批號(hào)2019101512，水分11.96%，含量按干燥品計(jì)算為0.302%）土炒山藥樣品9 份，每份約0.27 g，每份精密加入濃度為448.00 μg/mL 的尿囊素對(duì)照品貯備液適量，照“2.2.3”項(xiàng)下操作，配制成低、中、高濃度供試品溶液各3 份進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4，數(shù)據(jù)表明加樣回收率較好。

表4 尿囊素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.11 樣品含量測(cè)定 取序號(hào)T1～T8 土炒山藥樣品8批，分別制備供試品溶液并測(cè)定尿囊素峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算尿囊素含量（按干燥品計(jì)），結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果 %

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別

徐自升等［14］采用薄層色譜鑒別方法，鑒別了生山藥、麩炒山藥，目前尚未見(jiàn)有采用薄層色譜鑒別土炒山藥的報(bào)道。本研究按《中國(guó)藥典》2020 年版一部山藥項(xiàng)下薄層色譜法對(duì)土炒山藥進(jìn)行鑒別,實(shí)驗(yàn)表明該方法可用于土炒山藥的薄層色譜鑒別。

3.2 含量測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取尿囊素對(duì)照品適量，加溶劑制成含尿囊素濃度為29 μg/mL 溶液，用紫外分光光度計(jì)在300～200 nm 范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在300～240 nm 范圍內(nèi)尿囊素吸收度很小且隨波長(zhǎng)的減小變化不大，在240～200 nm 范圍內(nèi)尿囊素吸收度隨波長(zhǎng)的減小急劇上升。文獻(xiàn)方法多采用212 nm、224 nm 檢測(cè)波長(zhǎng)，本研究中溶劑為20%乙醇溶液，流動(dòng)相為甲醇-（3.4 g/L）磷酸二氫鉀緩沖溶液，考慮乙醇、甲醇末端吸收較強(qiáng)，截止使用波長(zhǎng)為205 nm，212 nm 靠近205 nm，故選擇224 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 含量測(cè)定色譜柱、流動(dòng)相及流速的選擇

尿囊素別名5-脲基乙內(nèi)酰脲，屬于咪唑類雜環(huán)化合物，極性很大，在反相色譜中如用常規(guī)的色譜條件（如非耐水性C18 柱、流動(dòng)相中有機(jī)溶劑不低于5%、流速為0.8 mL/min）保留時(shí)間很短（約3 min ），分離度難以達(dá)到要求，且色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。為了延長(zhǎng)尿囊素保留時(shí)間達(dá)到有效分離，在本研究中降低有機(jī)相的比例和流速。流動(dòng)相中有機(jī)溶劑低于5%時(shí)，一般應(yīng)選用耐水性O(shè)DS 柱以達(dá)到色譜系統(tǒng)穩(wěn)定［15］。本研究選用耐水性C18 柱比較了三種高水相流動(dòng)相系統(tǒng)：（1）純水作流動(dòng)相；（2）甲醇-水系統(tǒng)，兩者的比例分別為1∶99 和0.5∶99.5；（3）甲醇-磷酸二氫鉀緩沖液系統(tǒng)，兩者的比例分別為（1∶99）、（2∶98）。經(jīng)比較，選用甲醇-磷酸二氫鉀緩沖液（1∶99）作為流動(dòng)相系統(tǒng)適用性較好。同時(shí)比較了0.8 mL/min、0.6 mL/min、0.4 mL/min 三種流速，隨流速的降低尿囊素保留時(shí)間延長(zhǎng)。

試驗(yàn)結(jié)果表明采用YMC HPLC Column C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）耐水柱用于分析方法的建立，采用ZORBAX SB-Aq C18 耐水柱做耐用性試驗(yàn)；甲醇-（3.4 g/L）磷酸二氫鉀緩沖液（1∶99）作為流動(dòng)相；流速為0.4 mL/min，尿囊素保留時(shí)間可達(dá)8 min 左右，土炒山藥樣品中尿囊素與相鄰雜質(zhì)峰有良好的分離且基線穩(wěn)定，系統(tǒng)適用性達(dá)到要求。

3.4 供試品的處理

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［11-12］，尿囊素對(duì)熱不穩(wěn)定，供試品制備用20%乙醇溶液超聲提取30 min,提取率較高。但在功率300 w，40 kHz 的超聲儀中超聲30 min 產(chǎn)生大量熱量導(dǎo)致供試品溶液溫度上升，故本研究采用冰浴中超聲30 min 以降低溫度。山藥中含有大量的淀粉、黏液蛋白、黏液多糖，故在進(jìn)樣前用離心機(jī)（4 000 r/min）離心10 min，上清液用微孔濾膜過(guò)濾，以消除雜質(zhì)的干擾。

3.5 不同生產(chǎn)單位樣品中的含量

本研究測(cè)試了A、B、C、D 四個(gè)不同公司土炒山藥飲片中尿囊素的含量，結(jié)果相差較大，含量在0.157%～0.302%之間，因樣品量較少無(wú)規(guī)律性可循。土炒山藥中尿囊素含量差異是否受產(chǎn)地、采收季節(jié)、炮制工藝（如切制、炒制時(shí)間與程度、翻炒速度與頻次、火候等）的影響有待進(jìn)一步研究。

本研究的薄層色譜鑒別方法，可以用于土炒山藥的定性鑒別；高效液相色譜法測(cè)定尿囊素含量準(zhǔn)確，方法簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定，可用于土炒山藥的定量質(zhì)量控制。