胡高波，朱瑞，金湛，魏自太#（.衢州職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)學院，浙江 衢州 34000；.浙江中醫(yī)藥大學藥學院，杭州 30053）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率高[1]。據(jù)WHO國際癌癥研究機構(gòu)數(shù)據(jù)顯示，2020年乳腺癌全球新發(fā)226萬例，占新發(fā)癌癥病例的11.7%，成為全球第一大癌癥。中國是乳腺癌大國，2020年新發(fā)乳腺癌約42萬例，并導致近12萬人死亡[2]?；熑允悄壳爸委熑橄侔┑闹饕绞?，其在縮小病灶、減少手術(shù)造成的傷殘、提高乳腺癌患者生存率等方面具有較大優(yōu)勢[3]，但耐藥性是無法避免的現(xiàn)實問題[4]。氟維司群（fulvestrant，F(xiàn)ul）作為治療乳腺癌的一種新型抗雌激素藥物[5]，其耐藥性問題仍是急需突破的瓶頸[6－8]。

冬凌草甲素（oridonin，Ori）是從冬凌草植物中提取的二萜類化合物，具有良好的抗腫瘤活性，對白血病細胞、胃癌細胞的耐藥性具有較好的逆轉(zhuǎn)作用[9－11]。相關(guān)研究表明，通過調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）信號通路，可以達到逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的效果[12]。本團隊前期通過研究證明Ori可能通過誘導乳腺癌MCF-7/Ful細胞產(chǎn)生DNA損傷，引起細胞凋亡、細胞周期阻滯及細胞自噬，從而逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7細胞對Ful的耐藥[13]。因此，本研究擬通過檢測PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的表達，以及裸鼠腫瘤質(zhì)量和體積的變化，進一步探討Ori逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7細胞對Ful耐藥的機制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括BB150型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）、TDL-4型低速離心機（浙江納德科學儀器有限公司）、Mini-PROTEAN型電泳儀（美國Bio-Rad公司）、ChemiScope 6200 Touch型化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學儀器有限公司）、FA1004N型電子天平（上海儀天科學儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑包括Ori對照品（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%），F(xiàn)ul對照品（美國Sigma公司，純度≥98%），DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Hyclone公司），MTT（北京索萊寶科技有限公司，批號1021C018），BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號P0032），兔源PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（美國CST公司），青霉素、鏈霉素（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）等。

1.3 細胞與動物

人乳腺癌MCF-7細胞株購自中國科學院上海細胞庫。SPF級BALB/c裸鼠，4周齡，雄性，體質(zhì)量20～25 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產(chǎn)合格證號為SCXK（滬）2017-0009，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心。本研究經(jīng)衢州職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)學院動物倫理中心審批通過，倫理號：20191209-09。

2 方法

2.1 Ori體外逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7細胞對Ful耐藥機制的驗證

2.1.1 耐藥細胞誘導及培養(yǎng) 將不耐藥的正常乳腺癌MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、200 U/mL青霉素、200 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，并于培養(yǎng)液中加入Ful，壓力（Ful濃度為1 μmol/L）篩選12個月，誘導細胞耐藥。然后調(diào)整Ful劑量為0.5 μmol/L，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，即得對Ful耐藥的乳腺癌MCF-7/Ful細胞，用于后續(xù)實驗。藥物劑量參考文獻[13]和前期預實驗結(jié)果設(shè)置。

2.1.2 MCF-7和MCF-7/Ful細胞相對細胞活力檢測 采用MTT法進行檢測。取對數(shù)生長期的正常MCF-7細胞及“2.1.1”項下MCF-7/Ful細胞，接種至96孔板中，每孔3 000個細胞。將細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞完全貼壁后，根據(jù)預實驗結(jié)果，每孔加入不同濃度[0（對照）、0.1、1、10、20、50 μmol/L]的Ful，每個濃度設(shè)置4個復孔；另設(shè)空白培養(yǎng)基組，藥物劑量參考文獻[13]和前期預實驗結(jié)果設(shè)置。藥物作用48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔再加入三聯(lián)裂解液（鹽酸+十二烷基硫酸鈉+異丙醇）200 μL，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中放置18 h后，使用酶標儀在570 nm波長處測定各孔的光密度（OD），并計算相對細胞活力。相對細胞活力（%）＝（實驗組OD570－空白培養(yǎng)基組OD570）/（對照組OD570－空白培養(yǎng)基組OD570）×100%。實驗重復3次。

2.1.3 MCF-7/Ful細胞抑制率及聯(lián)合指數(shù)檢測 采用MTT法進行檢測。取“2.1.1”項下MCF-7/Ful細胞，接種至96孔板中，每孔3 000個細胞。待細胞貼壁后，用不同濃度的Ori[0（對照）、5、10 μmol/L]和Ful[0（對照）、4、8、12、16、20 μmol/L]單獨及聯(lián)合使用處理細胞48 h，每個濃度設(shè)置4個復孔。藥物劑量依據(jù)前期預實驗結(jié)果設(shè)置。每孔加入MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h后，再加入三聯(lián)裂解液（鹽酸+十二烷基硫酸鈉+異丙醇）200 μL，繼續(xù)放置18 h后，使用酶標儀在570 nm波長處測定OD，并計算細胞抑制率。細胞抑制率（%）＝（對照組OD570－實驗組 OD570）/對照組 OD570×100%，實驗重復 3 次。采用CompuSyn軟件繪制不同聯(lián)合效應下的抑制率-聯(lián)合指數(shù)關(guān)系圖，計算不同劑量組合下的聯(lián)合指數(shù)。

2.1.4 MCF-7/Ful細胞中PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的檢測 采用Western blot法進行檢測。取“2.1.1”項下MCF-7/Ful細胞接種至6孔板中，每孔6×105個細胞。將細胞隨機分為空白對照組、Ful組（5 μmol/L）、Ori組（8 μmol/L）、Ful（5 μmol/L）+Ori（8 μmol/L）組，每組設(shè)置4個復孔。待細胞貼壁后，按上述分組加入相應的藥物或磷酸鹽緩沖液。藥物劑量依據(jù)前期預實驗結(jié)果設(shè)置。作用24 h后加入RIPA裂解液，于冰上裂解30 min后離心（3 000 r/min，5 min），取上清液，凝膠電泳分離總蛋白。電壓開始設(shè)置為80 V，當?shù)鞍讟悠愤M入分離膠后，電壓提高到120 V，參照預染Marker的位置，待目的條帶進入凝膠最佳分離區(qū)時，停止電泳。在凝膠上面鋪上經(jīng)甲醇和轉(zhuǎn)膜液浸濕的PVDF膜，在PVDF膜上再放3層浸過轉(zhuǎn)膜液的濾紙，放上第2塊海綿墊，放入轉(zhuǎn)移槽中，槽中灌滿轉(zhuǎn)膜液，打開電源，穩(wěn)流200 mA（120 min）。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜并做好標記，用TBST洗膜10 min×3次。將PVDF膜放入孵育盒中，加入含5%脫脂奶粉的封閉液，搖床振蕩1.5～2.0 h；封閉結(jié)束后，用TBST洗膜10 min×3次。加入p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、GAPDH一抗（稀釋度均為1∶1 000），4℃孵育過夜；洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1∶2 000），室溫孵育2 h，顯影。采用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度值分析，以PI3K、Akt蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目標蛋白的表達水平，以p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值分別表示PI3K、Akt的磷酸化水平。

2.2 Ori體內(nèi)逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7細胞對Ful耐藥機制的驗證

采用裸鼠移植瘤模型進行體內(nèi)實驗驗證。將裸鼠隨機分為空白對照組、Ful組（80 μmol/g）、Ori組（50 μmol/g）、Ful（80 μmol/g）+Ori（50 μmol/g）組，每組8只，分籠飼養(yǎng)。藥物劑量由前期預實驗結(jié)果確定。取“2.1.1”項下MCF-7/Ful細胞，胰酶消化后，用生理鹽水調(diào)整細胞密度為1×107個/mL，以每只裸鼠0.2 mL接種于裸鼠背部皮下，觀察移植瘤的生長情況。待腫瘤生長至100 mm3左右時，按分組腹腔注射相應的藥物或磷酸鹽緩沖液，每4天1次，每次注射前用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，持續(xù)28 d。腫瘤體積＝1/2長徑×2倍短徑。給藥結(jié)束后采用CO2處死裸鼠，解剖裸鼠取出腫瘤，稱量腫瘤質(zhì)量，計算抑瘤率。抑瘤率（%）＝[（空白對照組腫瘤質(zhì)量－給藥組腫瘤質(zhì)量）/空白對照組腫瘤質(zhì)量]×100%。

2.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1MCF-7和MCF-7/Ful細胞相對細胞活力的檢測結(jié)果

MTT法檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)ul能夠不同程度地抑制MCF-7和MCF-7/Ful細胞增殖，且具有劑量依賴趨勢。當Ful≥10 μmol/L時，MCF-7/Ful細胞的相對細胞活力顯著高于MCF-7細胞（P＜0.05），結(jié)果見圖1。在Ful作用下，MCF-7/Ful細胞活力越大，代表其耐藥性越強。

圖1 Ful作用下MCF-7和MCF-7/Ful細胞的相對細胞活力折線圖

3.2Ori對MCF-7/Ful細胞抑制率的影響及聯(lián)合指數(shù)結(jié)果

MTT法檢測結(jié)果顯示，Ori能夠?qū)CF-7/Ful細胞產(chǎn)生抑制，且具有劑量依賴趨勢。當Ori和Ful聯(lián)合使用時，與兩者相應劑量單獨使用時對比，MCF-7/Ful細胞的抑制率均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果見表1。結(jié)果表明，Ori能夠逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7細胞對Ful的耐藥，且與Ful聯(lián)合使用后，逆轉(zhuǎn)耐藥效果更強。通過CompuSyn軟件繪制得到抑制率-聯(lián)合指數(shù)關(guān)系圖（圖2）。如圖2所示，各劑量組聯(lián)合指數(shù)均在橫線下方，即聯(lián)合指數(shù)均小于1，具有協(xié)同作用[14]。當Ori劑量為5 μmol/L、Ful劑量為8 μmol/L時，聯(lián)合指數(shù)最小。

表1 乳腺癌MCF-7/Ful細胞抑制率（±s，n＝4）

表1 乳腺癌MCF-7/Ful細胞抑制率（±s，n＝4）

a：與相應劑量Ful單獨使用比較，P＜0.05；b：與相應劑量Ori單獨使用比較，P＜0.05；c：與相應劑量Ori單獨使用比較，P＜0.01

Ful 20 μmol/L 42.12±5.69 60.63±5.41ac 71.69±6.56ac Ori/（μmol/L）0 5 1 0 Ful 0 μmol/L 0 17.32±3.23 31.64±4.23 Ful 4 μmol/L 14.23±1.32 32.36±2.36ab 39.69±5.12ab Ful 8 μmol/L 28.31±2.36 55.32±5.63ac 59.69±5.98ab Ful 16 μmol/L 35.1±4.23 59.21±5.12ac 69.32±6.12ab

圖2 Ful和Ori聯(lián)合使用的抑制率-聯(lián)合指數(shù)關(guān)系圖

3.3 Ori對乳腺癌MCF-7/Ful細胞中PI3K/Akt信號通路的影響

與空白對照組比較，Ori組和Ful+Ori組細胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值及Ful組細胞中p-PI3K/PI3K比值均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與Ful組比較，F(xiàn)ul+Ori組細胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖3。

圖3 乳腺癌MCF-7/Ful細胞中PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達的檢測結(jié)果

3.4 Ori和Ful的體內(nèi)抑瘤效應驗證結(jié)果

與空白對照組和Ful組比較，F(xiàn)ul+Ori組裸鼠的腫瘤生長速度明顯降低，腫瘤體積從12 d開始具有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01），各組裸鼠的腫瘤體積變化曲線見圖4。給藥結(jié)束后，與空白對照組和Ful組比較，F(xiàn)ul+Ori組裸鼠腫瘤質(zhì)量著減?。≒＜0.01）；Ful+Ori組的抑瘤率為（63.90±4.11）%，較Ful組顯著增加（P＜0.01），各組裸鼠腫瘤質(zhì)量與抑瘤率見表2。

圖4 各組裸鼠的腫瘤體積變化曲線

表2 各組裸鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率結(jié)果比較（±s，n＝8）

表2 各組裸鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率結(jié)果比較（±s，n＝8）

a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與Ful組比較，P＜0.01；－：無數(shù)據(jù)

抑瘤率/%－13.40±3.32 17.00±2.36 63.90±4.11b組別空白對照組Ori組Ful組Ful+Ori組腫瘤質(zhì)量/g 3.30±0.65 2.84±0.36 2.74±0.25 1.19±0.12ab

4 討論

現(xiàn)階段乳腺癌的治療以化療為主，但長期化療會造成人體損傷，引發(fā)毒副作用和耐藥。耐藥性的產(chǎn)生是乳腺癌患者臨床治療失敗的主要原因。Ful是近年來開發(fā)的一種抗雌激素藥物，因其可靠的臨床效果及獨特的作用機制，受到臨床好評，但Ful的耐藥性仍是急需解決的問題[15－17]。

Ori對腫瘤具有一定的預防和治療作用，能夠抑制肝癌、卵巢癌及胃癌等多種腫瘤細胞的增殖，在逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥方面有一定效果[18－20]。本研究通過Ful誘導乳腺癌MCF-7細胞獲得耐藥性MCF-7/Ful細胞，同時不同濃度的Ori可以對乳腺癌MCF-7/Ful細胞產(chǎn)生明顯的抑制作用，表明Ori能夠逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7細胞對Ful的耐藥。通過CompuSyn軟件分析發(fā)現(xiàn)，5 μmol/L的Ori和8 μmol/L的Ful聯(lián)合作用時，相關(guān)聯(lián)合指數(shù)最小，表明二者聯(lián)用對乳腺癌MCF-7/Ful細胞抑制效果最好，逆轉(zhuǎn)耐藥效果也最佳。

PI3K/Akt信號通路的異常活化在大多數(shù)腫瘤中都有發(fā)生。研究表明，PI3K/Akt信號通路在介導腫瘤多藥耐藥導致化療和放療抵抗方面發(fā)揮著重要作用[21]。本研究結(jié)果顯示，與Ful組比較，F(xiàn)ul+Ori組細胞中p-PI3K/PI3K比值、p-Akt/Akt比值顯著降低，表明Ful和Ori聯(lián)合使用后能夠有效抑制PI3K和Akt的磷酸化，發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。

裸鼠因胸腺缺失，缺乏成熟的T淋巴細胞，能夠使移植后的腫瘤細胞生長良好，并能保持腫瘤細胞原有的形態(tài)和病理特性，成為腫瘤研究中較為理想的動物實驗工具[22]。為進一步驗證Ori逆轉(zhuǎn)耐藥的體內(nèi)效應，本研究采用乳腺癌MCF-7/Ful耐藥細胞構(gòu)建了裸鼠移植瘤模型。實驗結(jié)果表明，Ori聯(lián)合Ful能夠明顯減緩腫瘤生長速度，降低腫瘤質(zhì)量，提高抑瘤率。

綜上所述，Ori能夠逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7細胞對Ful的耐藥，此作用可能是通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路實現(xiàn)的，逆轉(zhuǎn)耐藥效果在裸鼠體內(nèi)也得到驗證，本研究可為乳腺癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。