孟祥熙，田雨沫，胡森，王莉莉，張慧蘋，鐘毓賢，王宏偉，丁宇（.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形科，河北 承德 067000；.解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究部創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生研究中心，北京 008；.解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心中醫(yī)醫(yī)學(xué)部康復(fù)醫(yī)學(xué)科，北京 0008；.解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心病理科，北京 0007；.解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心中醫(yī)醫(yī)學(xué)部骨傷科，北京 0008）

隨著人類海洋活動的增加，海難或海戰(zhàn)時(shí)落海傷員常同時(shí)伴有燒傷和海水浸泡。由于海上環(huán)境特殊，醫(yī)療救助受限，往往難以及時(shí)開展有效的靜脈液體復(fù)蘇，導(dǎo)致傷員死亡率升高，救治難度增加[1]。若在傷后早期給予抗休克維持藥物，提高機(jī)體對休克的耐受能力，保護(hù)心腦等重要臟器功能，就能為后續(xù)救治爭取時(shí)間，從而提高傷員生存率。丙戊酸鈉是一種組蛋白去乙?；敢种苿?，既往研究發(fā)現(xiàn)，在失血性休克或致死性燙傷動物實(shí)驗(yàn)中，丙戊酸鈉能保護(hù)重要臟器功能，提高動物生存率[2－5]。因此，本研究通過構(gòu)建嚴(yán)重燙傷合并海水浸泡延遲補(bǔ)液大鼠模型，并在燙傷后立即皮下注射大劑量丙戊酸鈉，從而探究其對大鼠損傷心腦的保護(hù)作用，以期為丙戊酸鈉用于燒傷合并海水浸泡傷員的救治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

PowerLab型多導(dǎo)生理記錄儀購自澳大利亞ADInstruments公司；RAPIDPoint 500型血?dú)夥治鰞x購自德國Siemens公司；KD-BM型生物組織包埋機(jī)購自金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；CKX53型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；ST360型酶標(biāo)儀購自上?？迫A生物工程股份有限公司；數(shù)字測溫儀購自衡水創(chuàng)紀(jì)儀器儀表有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

丙戊酸鈉對照品（批號B2013169，純度≥98%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；戊巴比妥鈉（批號P3761，純度≥98%）購自美國Sigma公司；乳酸鈉林格注射液（批號2010242107，規(guī)格500 mL）購自石家莊四藥有限公司；肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（批號分別為202107、202104）均購自上海江萊生物科技有限公司。

1.3 人工海水

人工海水按照國家海洋局第三海洋研究所提供的海水主要成分配制，其滲透壓為（1 250±11）mmol/L，pH為8.20，含鈉離子（630±5）mmol/L、鉀離子（10.88±0.68）mmol/L、氯離子（658.8±5.5）mmol/L，溫度為（23±1）℃。

1.4 動物

雄性SD大鼠180只，60～70日齡，體質(zhì)量250～300 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2019-0010。購進(jìn)后，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)于22～25℃的飼養(yǎng)房內(nèi)1周以上，自由飲食。大鼠飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)過程均嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動物管理與保護(hù)準(zhǔn)則。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為燙傷+延遲補(bǔ)液組（S組）、燙傷+海水浸泡+延遲補(bǔ)液組（SS組）、燙傷+海水浸泡+丙戊酸鈉+延遲補(bǔ)液組（SSV組），每組60只。術(shù)前禁食12 h、自由飲水，所有大鼠稱定體質(zhì)量后給予戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，固定、消毒，解剖分離一側(cè)頸總動脈、靜脈，分別插管，剪除頸背部和臀部毛發(fā)。采用沸水水浴法建立Ⅲ度燙傷模型：將大鼠頸背部和臀部浸泡于100℃沸水中15 s造成35%總體表面積Ⅲ度燙傷，燙傷深度經(jīng)病理組織切片檢查證實(shí)。SS組和SSV組大鼠燙傷后立即浸泡于人工海水中（30 min），其中SSV組出水后即刻皮下注射丙戊酸鈉300 mg/kg[6－7]。燙傷后2 h，各組按1/2 Parkland公式（4 mL×1%燒傷面積×kg）于30 min內(nèi)靜脈注射乳酸鈉林格注射液進(jìn)行延遲補(bǔ)液，在燙傷后的第1個(gè)8 h補(bǔ)入總量的1/2[8]。

2.2 大鼠生存情況觀察

每組取20只大鼠。S組燙傷后即刻觀察，SS組和SSV組海水浸泡后開始觀察，每30 min觀察1次，連續(xù)觀察24 h，記錄大鼠死亡時(shí)間，計(jì)算各組大鼠平均生存時(shí)間和24 h生存率。24 h生存率（%）＝（各組大鼠燙傷后24 h生存只數(shù)/各組總只數(shù)）×100%。

2.3 大鼠生命體征檢測

每組分別在燙傷前、燙傷后0 h、燙傷后2 h、燙傷后5 h這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)取10只大鼠，采用多導(dǎo)生理記錄儀檢測大鼠的平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）、心率（heart rate，HR）、呼吸頻率（respiration rate，RR），采用數(shù)字測溫儀插入大鼠肛門10 cm處檢測其直腸溫度（rectal temperature，RT）[9]。

2.4 大鼠動脈血?dú)夂团K器功能指標(biāo)檢測

抽取“2.3”項(xiàng)下各組同批次大鼠4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的頸動脈血，采用血?dú)夥治鰞x檢測血?dú)夥治鲋笜?biāo)，包括pH、動脈血氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）、動脈血二氧化碳分壓（arterial partial pressure of carbon dioxide，PaCO2）、實(shí)際碳酸氫根（HCO3－）；將抽取的頸動脈血離心后取血清，按照試劑盒說明書操作以酶標(biāo)儀檢測血清中CK-MB、NSE水平。

2.5 大鼠心臟、腦組織病理觀察

抽血后，將“2.4”項(xiàng)下各組同批次大鼠處死，每只大鼠取相同位置心臟、腦組織各1塊，使用10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片（5 μm），常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色后，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存曲線比較采用Log-rank檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠平均生存時(shí)間及24 h生存率檢測結(jié)果

S組大鼠的平均生存時(shí)間為（1 424.5±10.68）min，24 h生存率為90%；SS組大鼠的平均生存時(shí)間為（972.05±128.52）min，24 h生存率為55%；SSV組大鼠的平均生存時(shí)間為（1 240.80±84.66）min，24 h生存率為75%。與S組大鼠比較，SS組大鼠24 h生存率顯著降低（P＜0.05）；與SS組大鼠比較，SSV組大鼠24 h生存率顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠24 h生存曲線圖

3.2 大鼠生命體征檢測結(jié)果

與S組比較，SS組大鼠燙傷后0、2、5 h的MAP、RT、HR和燙傷后0、2 h的RR均顯著降低（P＜0.05）；與SS組比較，SSV組大鼠燙傷后2、5 h的MAP、RT、HR和燙傷后2 h的RR均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1（表中，1 mmHg＝133.322 Pa）。

表1 各組大鼠生命體征檢測結(jié)果（±s，n＝10）

表1 各組大鼠生命體征檢測結(jié)果（±s，n＝10）

a：與S組比較，P＜0.05；b：與SS組比較，P＜0.05

指標(biāo)MAP/mmHg RT/℃RR/（次/min）HR/（次/min）燙傷前126.2±5.5 127.1±6.9 125.5±7.8 36.8±0.6 36.7±0.7 36.7±0.5 95.7±4.6 94.6±5.9 96.0±5.8 435.2±40.7 431.2±45.0 443.9±34.3組別S組SS組SSV組S組SS組SSV組S組SS組SSV組S組SS組SSV組燙傷后0 h 125.5±6.9 109.1±11.8a 108.7±10.8 36.6±1.4 27.1±1.1a 27.2±1.1 93.1±7.7 81.9±5.1a 82.1±4.6 444.1±30.9 355.1±28.6a 351.2±31.2燙傷后2 h 123.4±6.8 92.4±13.4a 111.2±7.9b 35.2±1.2 28.2±1.8a 29.9±0.9b 87.1±3.4 80.7±10.2a 82.9±12.8b 369.8±24.0 310.6±35.7a 347.7±30.1b燙傷后5 h 126.3±6.9 98.8±14.1a 114.3±13.1b 35.7±1.4 30.5±1.7a 32.2±1.6b 92.4±8.6 92.7±7.5 90.9±5.8 405.8±32.1 334.0±37.6a 381.2±56.4b

3.3 大鼠動脈血?dú)夂团K器功能指標(biāo)檢測結(jié)果

與S組比較，SS組大鼠燙傷后0、2、5 h的動脈血pH、PaO2、HCO3－均顯著降低（P＜0.05），血清CK-MB、NSE水平均顯著升高（P＜0.05），燙傷后2、5 h的動脈血PaCO2顯著升高（P＜0.05）；與SS組比較，SSV組大鼠燙傷后2、5 h的pH、PaO2、HCO3－均顯著升高（P＜0.05），CK-MB、NSE水平和PaCO2均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠動脈血?dú)夂团K器功能指標(biāo)檢測結(jié)果（±s，n＝10）

表2 各組大鼠動脈血?dú)夂团K器功能指標(biāo)檢測結(jié)果（±s，n＝10）

a：與S組比較，P＜0.05；b：與SS組比較，P＜0.05

指標(biāo)pH PaO2/mmHg PaCO2/mmHg HCO3－/（mmol/L）CK-MB/（U/L）NSE/（ng/mL）燙傷后5 h 7.37±0.03 7.26±0.04a 7.35±0.07b 124.9±7.8 112.9±7.1a 121.9±7.3b 38.5±3.7 46.0±3.3a 42.6±3.0b 17.8±2.9 13.6±2.9a 16.9±2.6b 1 045.5±78.3 1 907.8±192.5a 1 540.5±190.4b 9.7±1.7 15.2±2.1a 11.8±2.2b組別S組SS組SSV組S組SS組SSV組S組SS組SSV組S組SS組SSV組S組SS組SSV組S組SS組SSV組燙傷前7.38±0.02 7.39±0.03 7.40±0.04 127.9±7.2 128.1±7.8 128.1±7.4 35.5±3.2 35.3±3.8 35.3±3.6 22.9±2.7 22.2±3.6 22.9±3.4 626.7±51.5 625.2±65.6 625.7±66.4 7.5±1.1 7.6±1.2 7.5±1.1燙傷后0 h 7.31±0.04 7.24±0.07a 7.25±0.07 120.7±7.0 114.7±7.5a 114.1±7.1 37.6±3.5 38.2±2.8 38.3±2.5 17.5±2.0 14.5±2.2a 14.6±1.9 625.1±46.8 751.7±94.5a 757.7±74.6 7.5±1.7 13.2±2.8a 13.2±2.7燙傷后2 h 7.29±0.03 7.18±0.05a 7.27±0.08b 116.9±6.8 101.7±7.3a 108.8±6.5b 39.3±3.8 47.6±3.4a 43.9±3.1b 16.1±1.7 12.1±1.4a 13.8±1.8b 728.3±68.5 1 411.2±163.6a 1 197.2±195.8b 8.3±1.9 17.2±2.3a 13.8±2.1b

3.4 大鼠心臟、腦組織病理觀察結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，各組大鼠燙傷前心臟、腦組織結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞排列緊密，無水腫。在燙傷后2、5 h，大鼠心臟、腦組織間隙增寬，細(xì)胞腫脹，排列紊亂，且隨著時(shí)間的延長，損傷程度逐漸加重。其中，SS組大鼠心臟、腦組織損傷程度較S組明顯加重；而與SS組比較，SSV組大鼠心臟、腦組織損傷程度明顯減輕。結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 各組大鼠心臟組織病理顯微圖（HE染色，×400）

圖3 各組大鼠腦組織病理顯微圖（HE染色，×400）

4 討論

海水具有低溫、高滲透壓、高致病菌等特點(diǎn)，海水浸泡后易造成機(jī)體體溫降低、高滲性脫水、血流動力學(xué)紊亂、凝血功能障礙、心腦等重要臟器功能受損[10－13]。嚴(yán)重?zé)齻麜?dǎo)致大面積皮膚保護(hù)屏障受損，且海水浸泡會加劇創(chuàng)面滲出及組織脫水，增加休克的嚴(yán)重程度和組織的缺血缺氧性損害[14]。

丙戊酸鈉是一種組蛋白去乙?；敢种苿?，在臨床上常用于治療癲癇。既往研究發(fā)現(xiàn)，丙戊酸鈉能改善失血性休克和燙傷模型大鼠的心、腦、肺、腸等臟器功能，抑制炎癥反應(yīng)，降低血管通透性[6－7，15－17]。本研究通過建立35%總體表面積Ⅲ度燙傷合并海水浸泡延遲補(bǔ)液大鼠模型來研究丙戊酸鈉對大鼠心腦損傷的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，大鼠單純燙傷后24 h生存率為90%，燙傷后海水浸泡24 h生存率降低至55%，證實(shí)嚴(yán)重燙傷合并海水浸泡會提高病死率；而給予丙戊酸鈉治療后，大鼠24 h生存率提高至75%，平均生存時(shí)間顯著延長。CK-MB和NSE是反映心臟和腦組織損傷的重要標(biāo)志物[18－19]，本研究中，SS組和SSV組大鼠燙傷后0、2、5 h的CK-MB、NSE水平均較S組顯著升高；給予丙戊酸鈉治療后，在燙傷后2、5 h，CK-MB、NSE水平均較SS組顯著降低。這提示在嚴(yán)重燙傷合并海水浸泡延遲補(bǔ)液的治療過程中，海水浸泡后即刻給予丙戊酸鈉治療，能提高大鼠燙傷后早期生存率，延長其生存時(shí)間，保護(hù)其心腦功能。

海水浸泡后引起大鼠中心溫度降低、血壓及HR下降、呼吸抑制、循環(huán)功能紊亂，合并嚴(yán)重?zé)齻麜r(shí)，損傷程度進(jìn)一步加重[9，20]。在本研究中，燙傷合并海水浸泡后大鼠RT、RR、MAP、HR均顯著降低，隨燙傷后時(shí)間延長及延遲補(bǔ)液，其燙傷后5 h的RT、MAP、HR仍低于S組，證實(shí)燙傷合并海水浸泡后機(jī)體損傷程度較單純燙傷更加嚴(yán)重，生命體征更加不平穩(wěn)；給予丙戊酸鈉治療后，在燙傷后2、5 h，大鼠RT、MAP、HR均較SS組顯著升高，表明丙戊酸鈉有助于燙傷大鼠血流動力學(xué)的穩(wěn)定，并可維持其基本生命體征平穩(wěn)，增加其對休克的抵抗能力。

嚴(yán)重?zé)齻讓?dǎo)致低血容量性休克、組織和器官灌注不足、細(xì)胞缺血缺氧、酸堿代謝產(chǎn)物失衡[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，與S組比較，SS組燙傷后0、2、5 h的pH、PaO2、HCO3－顯著降低，燙傷后2、5 h的PaCO2顯著升高，表明海水浸泡會加重燙傷后缺血缺氧性損害，酸性代謝產(chǎn)物增多；給予丙戊酸鈉治療后，SSV組大鼠燙傷后2、5 h的pH、PaO2、HCO3－均較SS組顯著升高，PaCO2顯著降低，表明丙戊酸鈉在嚴(yán)重燙傷合并海水浸泡延遲補(bǔ)液模型大鼠中，能改善其細(xì)胞缺血缺氧狀態(tài)，維持酸堿平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。病理結(jié)果提示，各組燙傷后2、5 h的心臟和腦組織間隙增寬，細(xì)胞腫脹，結(jié)構(gòu)紊亂，隨傷后時(shí)間延長，組織損傷越重；在燙傷后2、5 h，SS組損傷程度較S組明顯加重，而SSV組損傷程度較SS組明顯減輕，表面丙戊酸鈉能減輕嚴(yán)重燙傷合并海水浸泡延遲補(bǔ)液大鼠心腦損傷，維持其正常結(jié)構(gòu)，保護(hù)其心腦功能。

綜上所述，丙戊酸鈉能延長嚴(yán)重燙傷合并海水浸泡延時(shí)補(bǔ)液模型大鼠的生存時(shí)間，提高其生存率，保護(hù)其心腦功能，改善其細(xì)胞缺血缺氧狀態(tài)，提高其機(jī)體抗休克能力。但由于燙傷合并海水浸泡機(jī)制復(fù)雜，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入探究。