劉 杰，劉長河，王艷艷（河南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，鄭州 450004）

清眩丸為2020年版《中國藥典》（一部）收載品種，是由薄荷、荊芥穗、川芎、白芷、石膏5味中藥加工制成的丸劑，分為大蜜丸和小蜜丸2種規(guī)格，具有散風(fēng)清熱之功效，主要用于風(fēng)熱頭暈?zāi)垦！⑵^痛、鼻塞、牙痛等癥狀[1]。另有研究報道，清眩丸還具有抗菌、消炎、降血壓等作用[2]。目前，對清眩丸及同處方清眩片成分測定和質(zhì)量控制的研究包括采用高效液相色譜法[3－5]、超高效液相色譜法[6]、液相色譜-質(zhì)譜法[7]測定其中1種或多種成分的含量，采用超高效液相色譜法建立清眩丸的指紋圖譜[8]，采用氣相色譜法測定清眩片中薄荷腦的含量[9]等。揮發(fā)性成分是清眩丸的重要有效成分，清眩丸中的薄荷含薄荷酮、薄荷腦等成分[10]，荊芥穗含胡薄荷酮、胡椒酮等成分[11－12]，川芎含藁本內(nèi)酯、丁烯基酜內(nèi)酯等成分[13]。其中，薄荷酮對內(nèi)毒素所致炎癥模型小鼠有保護(hù)作用[14]；薄荷腦具有明顯的抗腫瘤活性，對人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖有抑制作用[15]；胡薄荷酮對二甲苯所致耳廓腫脹模型小鼠、角叉菜膠所致足腫脹模型大鼠和脂多糖所致急性肺損傷模型大鼠的急性炎癥均有改善作用[16]；胡椒酮有平喘、止咳及抗菌作用[17]；藁本內(nèi)酯可加速藥物透過血腦屏障，具有抗凝、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)等藥理活性[18－20]。2020年版《中國藥典》（一部）清眩丸項下質(zhì)控內(nèi)容為采用薄層色譜法鑒別川芎和白芷，采用高效液相色譜法測定歐前胡素含量，但并未涉及其中揮發(fā)性成分的檢測。鑒于清眩丸中揮發(fā)性成分的重要性，本研究擬建立氣相色譜法測定清眩丸中5種揮發(fā)性成分（薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮、胡椒酮和藁本內(nèi)酯）的含量，旨在更加全面地控制該藥的質(zhì)量。

1 材料

1.1 主要儀器

Clarus 500型氣相色譜儀、火焰離子化檢測器（FID）、TotalChrom色譜數(shù)據(jù)工作站均購自美國Perkin-Elmer公司；SB-5200DT型超聲波清洗器購自寧波新芝生物科技股份有限公司；揮發(fā)油測定器購自成都蜀?？萍加邢薰?；AE240型十萬分之一電子天平購自瑞士Mettler Toledo公司；氣相色譜柱DB-5石英毛細(xì)管柱購自美國Agilent公司。

1.2 主要藥品與試劑

7批清眩丸樣品分別購自山西華康藥業(yè)股份有限公司（批號20210301、20201101）、北京同仁堂制藥有限公司同仁堂制藥廠（批號18013630、20010024、20010707）和河南潤弘本草制藥有限公司（批號200702、201103），規(guī)格均為每丸重6 g。薄荷、荊芥穗、川芎、白芷和石膏飲片均購自張仲景大藥房鄭州順河路店，由筆者鑒定均為真品；薄荷腦對照品（批號110728-201707，純度99.80%）購自中國食品藥品檢定研究院；薄荷酮對照品（批號PS020152，純度94.44%）、胡薄荷酮對照品（批號PS012550，純度99.50%）、胡椒酮對照品（批號PS020565，純度95.00%）、藁本內(nèi)酯對照品（批號PS011687，純度98.00%）均購自成都普思生物科技股份有限公司。其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為DB-5石英毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；載氣為氮氣（純度99.999%）；進(jìn)樣口溫度為200 ℃；分流進(jìn)樣，分流比為10∶1，進(jìn)樣量為1 μL；程序升溫：初始溫度為100℃保持2 min，然后以5℃/min升溫至220℃并保持2 min；FID溫度為250℃；氫氣流速為45 mL/min，空氣流速為450 mL/min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品貯備液 分別精密稱取對照品薄荷酮9.70 mg、薄荷腦13.18 mg、胡薄荷酮8.17 mg、胡椒酮7.80 mg、藁本內(nèi)酯66.79 mg，置于同一25 mL量瓶中，加乙酸乙酯使溶解并定容，搖勻，即得混合對照品貯備液，其中薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本內(nèi)酯的質(zhì)量濃度依次為0.388、0.527、0.327、0.312、2.672 mg/mL。

2.2.2 線性關(guān)系考察用混合對照品溶液 分別精密量取上述混合對照品貯備液1、1、1、2、5 mL，分別置于50、25、10、10、10 mL量瓶中，加乙酸乙酯定容，搖勻，即得線性關(guān)系考察用混合對照品溶液。5種混合對照品溶液中，各待測成分的質(zhì)量濃度由低到高依次為：薄荷酮0.008、0.016、0.039、0.078、0.194 mg/mL，薄荷腦 0.010、0.021、0.053、0.105、0.264 mg/mL，胡薄荷酮0.006、0.013、0.033、0.065、0.164 mg/mL，胡椒酮 0.006、0.012、0.031、0.062、0.156 mg/mL，藁本內(nèi)酯0.053、0.107、0.267、0.534、1.336 mg/mL。

2.2.3 清眩丸供試品溶液 取清眩丸（批號20210301），剪碎，取約12 g（相當(dāng)于2丸），精密稱定，置于500 mL燒瓶中，加水200 mL；連接揮發(fā)油測定器，自上端加水至超過刻度并溢流入燒瓶時為止；再加入乙酸乙酯4 mL，連接冷凝管，加熱回流提取4 h，放冷；由揮發(fā)油測定器上端小心吸取乙酸乙酯層，通過鋪有少量無水硫酸鈉的漏斗濾過，濾液置于10 mL量瓶中；再以乙酸乙酯分次洗滌揮發(fā)油測定器和冷凝管，每次約2 mL，洗滌液通過同一漏斗并入量瓶中；加乙酸乙酯定容，搖勻，即得清眩丸供試品溶液。

2.2.4 缺薄荷、缺荊芥穗和缺川芎陰性對照溶液 按處方比例，分別制備缺薄荷、缺荊芥穗、缺川芎的陰性對照樣品藥材粉末；取上述粉末適量，按處方比例加入蜂蜜輔料，混勻；按“2.2.3”項下方法處理，即得缺薄荷、缺荊芥穗和缺川芎陰性對照溶液。

2.3 測定方法及系統(tǒng)適用性考察

按“2.1”項下色譜條件，精密量取混合對照品溶液（薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本內(nèi)酯的質(zhì)量濃度依次為0.194、0.264、0.164、0.156、1.336 mg/mL）、清眩丸供試品溶液、缺薄荷陰性對照溶液、缺荊芥穗陰性對照溶液、缺川芎陰性對照溶液各1 μL，依次注入氣相色譜儀測定。結(jié)果顯示，在該色譜條件下，各待測成分峰與相鄰峰之間的分離度均大于1.5，5種待測成分的理論板數(shù)均大于10 000，色譜圖見圖1。由圖1所示，混合對照品溶液色譜圖和清眩丸供試品溶液色譜圖中均可見5種待測成分的色譜峰，而在3種缺味陰性對照溶液色譜圖中，則分別缺失相應(yīng)成分的色譜峰（薄荷酮除外），表明其他成分對待測成分無干擾。

圖1 混合對照品溶液、清眩丸供試品溶液和缺味陰性對照溶液的色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

按“2.1”項下色譜條件，分別精密量取線性關(guān)系考察用混合對照品溶液及混合對照品貯備液各1 μL進(jìn)樣測定，以成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，5種成分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均與其峰面積成良好的線性關(guān)系（r均大于0.999 0）。

2.5 定量限和檢測限測定

取線性關(guān)系考察用最低濃度的混合對照品溶液，逐級稀釋并進(jìn)樣測定，以信噪比10∶1和3∶1時的質(zhì)量濃度計為各待測成分的定量限和檢測限。結(jié)果見表1。

表1 清眩丸中5種揮發(fā)性成分測定的線性關(guān)系考察及定量限、檢測限結(jié)果

2.6 精密度試驗

取清眩丸（批號20210301）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本內(nèi)酯色譜峰面積的RSD依次為1.21%、1.23%、0.77%、0.73%、1.16%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取清眩丸（批號20210301）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別于0、4、8、12、16、20、24 h時進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本內(nèi)酯在24 h內(nèi)峰面積的RSD依次為1.53%、1.27%、1.27%、0.98%、1.58%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.8 重復(fù)性試驗

取同一批清眩丸（批號20210301）樣品，共6份，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，并采用外標(biāo)法計算5種成分的含量。結(jié)果顯示，薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本內(nèi)酯含量的RSD依次為1.19%、1.98%、1.04%、1.21%、1.30%（n＝6），表明本法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的清眩丸（批號20210301）樣品6份，每份約6 g，置于500 mL燒瓶中，分別精密加入已知質(zhì)量濃度的混合對照品乙酸乙酯溶液2 mL（薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本內(nèi)酯質(zhì)量濃度依次為0.216、0.435、0.472、0.151、2.807 mg/mL），混勻。按“2.2.3”項下方法制備加樣回收供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果顯示，薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本內(nèi)酯的平均加樣回收率依次為96.33%、96.92%、97.53%、96.80%、95.61%，RSD依次為1.23%、1.38%、1.81%、1.89%、0.77%（n＝6），表明方法準(zhǔn)確度良好。結(jié)果見表2。

表2 清眩丸中5種揮發(fā)性成分的加樣回收率試驗結(jié)果

2.10 樣品含量測定

取7批清眩丸樣品，剪碎，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，采用外標(biāo)法計算。每個樣品平行測定2次，取平均值。結(jié)果顯示，7批樣品中薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本內(nèi)酯的平均含量依次為 0.009～0.070、0.040～0.157、0.017～0.150、0.008～0.049、0.144～0.932 mg/g。結(jié)果見表3。

表3 7批清眩丸樣品中5種揮發(fā)性成分的含量測定結(jié)果（n＝2，mg/g）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇

清眩丸中各種揮發(fā)性成分的含量差異較大，若用溶劑直接提取制備供試品溶液，含量較低的成分難以被檢出，故本研究采用揮發(fā)油測定器提取并制備供試品溶液[1，21]。揮發(fā)油測定器上端加入乙酸乙酯，對比重大（藁本內(nèi)酯）和比重小的揮發(fā)性成分均起到了富集作用。提取完成后，用溶劑分次洗滌冷凝管和揮發(fā)油測定器，可減少成分損失。蒸餾法制得的供試品溶液中主要含揮發(fā)性成分，可延長色譜柱壽命。

3.2 色譜柱的選擇

筆者前期選用不同色譜柱測定后發(fā)現(xiàn)，采用色譜柱DB-WAX測定時，薄荷腦和胡薄荷酮色譜峰重疊，這可能是由于這2種成分的結(jié)構(gòu)相似，在極性較強的色譜柱上難以分離；采用色譜柱DB-624分析時，色譜基線抬高，且藁本內(nèi)酯的保留時間延長；而采用色譜柱DB-5分析時，各成分峰分離良好，故本研究選用色譜柱DB-5。

3.3 分析條件的選擇

筆者前期以不同的柱溫（80、100、120、150℃）進(jìn)行實驗，結(jié)果各成分難以分離，且高沸點成分的色譜保留時間太長；在程序升溫條件下，以不同的初始溫度（80、90、100℃）、終點溫度（160、200、220℃）及不同的升溫速率（2、5、10 ℃/min）進(jìn)行對比實驗，結(jié)果以“2.1”項下色譜條件的分離效果最佳。

3.4 主要揮發(fā)性成分的歸屬分析

根據(jù)色譜結(jié)果，缺薄荷陰性對照溶液色譜中未檢出薄荷腦色譜峰，薄荷酮色譜峰亦降低（圖1C）；缺荊芥穗陰性對照溶液色譜中未檢出胡薄荷酮和胡椒酮色譜峰（圖1D）；而缺川芎陰性對照溶液色譜中未檢出藁本內(nèi)酯色譜峰（圖1E）。這表明清眩丸中薄荷腦和薄荷酮主要源自薄荷，胡薄荷酮和胡椒酮主要源自荊芥穗，藁本內(nèi)酯主要源自川芎，與文獻(xiàn)報道基本一致[10－13]。

3.5 樣品含量測定結(jié)果的分析

本研究含量測定結(jié)果表明，藁本內(nèi)酯含量最高，薄荷酮、胡椒酮含量較低。同一廠家不同批號樣品中5種成分的含量相對穩(wěn)定，而不同廠家樣品中5種成分的含量差異明顯，這可能與不同廠家選用的飲片來源、質(zhì)量及加工工藝不同有關(guān)。另外，在2020年版《中國藥典》（一部）中，僅薄荷項下有薄荷腦含量規(guī)定，而其他藥材中揮發(fā)性成分的含量均無相應(yīng)規(guī)定，這也可能是造成樣品中各藥材質(zhì)量不一、各成分含量存在差異的原因。

綜上所述，本研究所建立的氣相色譜法簡便、準(zhǔn)確，能同時測定清眩丸中5種揮發(fā)性成分的含量，可更全面地控制其質(zhì)量。建議在清眩丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加揮發(fā)性成分含量測定項。