燕二偉，樊占杰，沈冰冰，張燚

胃癌(gastric cancer，GC)是一種起源于胃黏膜上皮的常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤，患病人數(shù)呈逐年增加趨勢(shì)，對(duì)人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。在大多數(shù)情況下，80%的胃癌是在晚期發(fā)現(xiàn)的[2-3]。目前，隨著治療的改善，包括手術(shù)、化學(xué)療法和成熟的內(nèi)窺鏡療法來治療胃癌，但大多數(shù)晚期胃癌的預(yù)后仍然很差[4]。大多數(shù)患者不可避免地死于腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。迄今為止，還沒有有效的治療策略來解決這個(gè)問題。因此，探索全新有效的抗胃癌治療藥物是必要的?；ㄆ焖伤?taxifolin，TXL)，也稱二氫槲皮素，是松科植物中常見的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗寄生蟲、抗炎、抗菌抗病毒和保護(hù)心肌細(xì)胞的藥理作用[5-9]?；ㄆ焖伤匾驯昏b定為多種癌癥的潛在的抗腫瘤藥，如骨肉瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，尤因肉瘤[10-11]。已有相關(guān)研究[12]表明，花旗松素具體體外抗腫瘤活性，能抑制人胃癌MGC細(xì)胞增殖，可通過調(diào)節(jié)AhR/CYP1A1信號(hào)通路路抑制胃癌的惡性進(jìn)展[13]。然而，花旗松素對(duì)高度侵襲性胃癌的影響和潛在機(jī)制仍未確定。因此，本研究探討花旗松素對(duì)胃癌細(xì)胞生長、運(yùn)動(dòng)以及氧化應(yīng)激的影響，以期為花旗松素治療胃癌提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 人胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和胰酶購自美國Invitrogen公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購自美國PIERCE公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)購自南京建成生物工程研究所；MatrigelTM底膜基質(zhì)、Transwell小室和人工基底膜購自美國BD公司；血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、波形蛋白(Vimentin)、神經(jīng)鈣黏蛋白(E-cadherin)、上皮鈣黏蛋白(N-cadherin)抗體購自美國Sigma公司；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗購自美國Santa Cruz公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin PE/7-AAD)購自南京凱基生物有限公司；高速低溫離心機(jī)購自美國Beckman公司；CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；電泳槽、電轉(zhuǎn)儀購自美國Bio-Rad公司；FACS Vantage SE流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；凝膠成像系統(tǒng)GDS-800 UVP購自美國UVP公司。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901細(xì)胞于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱用DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS和1%青-鏈霉素)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，吹打形成單細(xì)胞懸液，2～3 d傳代1次。實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 CCK8檢測(cè)細(xì)胞存活率 將SGC-7901細(xì)胞接種于96孔板(100 μL/孔)孵育24 h后，用不同濃度(0.5、1、2.5、5、10、20、50、100、200、300 μM)花旗松素處理細(xì)胞，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定。并計(jì)算花旗松素對(duì)SGC-7901細(xì)胞的半抑制濃度。

1.2.2 EdU染色檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞以每孔1×105接種于96孔板，分組處理培養(yǎng)后，于每孔中加入100 μL含50 μmol/L EDU培養(yǎng)基孵育2 h，用PBS洗滌2次，每次5 min。將細(xì)胞進(jìn)行固定和染色后用熒光顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取處理后的各組SGC-7901細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)48 h后，室溫下加入5 μL Annexin V FITC混勻，最后加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)10 μL避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 將Matrigel基質(zhì)膠稀釋后加入小室的上室(45 μL/孔)，37 ℃凝固5 h，取經(jīng)0、25、50、100 μM濃度花旗松素處理24 h后的SGC-7901細(xì)胞加入上室，下室加入500 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取下室，洗滌后用多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下觀測(cè)并計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 化學(xué)比色法檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo) 試劑盒檢測(cè)SOD的活性和MDA、GSH的水平，按照SOD、MDA和GSH測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化形態(tài)學(xué)觀察 取各組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，通過顯微鏡觀察各組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化形態(tài)學(xué)變化。

1.2.7 Western blot檢測(cè)VEGF、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)水平 各組SGC-7901細(xì)胞加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白含量。10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，200 mA恒流點(diǎn)轉(zhuǎn)移至PVDF膜。加入一抗VEGF(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、p38(1∶1 000)和p-p38(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液清洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG(1∶10 000)，膜上滴加電化學(xué)發(fā)光顯影液顯色。ImageJ V軟件分析各組TPC-1細(xì)胞目的蛋白與β-actin比值。

2 結(jié)果

2.1 花旗松素對(duì)SGC-7901細(xì)胞活力的影響 不同濃度花旗松素處理胃癌SGC-7901細(xì)胞24 h后，SGC-7901細(xì)胞的存活率以花旗松素濃度依賴的方式降低，當(dāng)花旗松素濃度超過50 μM時(shí)，SGC-7901細(xì)胞的存活率較花旗松素濃度為0.5 μM時(shí)顯著降低(P<0.05)，并計(jì)算得出IC50值=54.602，即選擇25、50、100 μM濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

2.2 花旗松素對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比較，花旗松素50、100 μM組EdU陽性細(xì)胞數(shù)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 花旗松素對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比較，花旗松素50、100 μM組細(xì)胞凋亡率均顯著降低(P<0.05)。見圖3。

2.4 花旗松素對(duì)SGC-7901細(xì)胞侵襲的影響 與對(duì)照組相比較，花旗松素50、100 μM組侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)。見圖4A、4B?；ㄆ焖伤?0、100 μM組VEGF和Vimentin的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見圖4C、4D。

2.5 花旗松素對(duì)SGC-7901細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響 與對(duì)照組比較，花旗松素50、100 μM組EMT受到抑制，細(xì)胞從棒狀或長梭形的間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為鵝卵石狀或紡錘體形的上皮細(xì)胞形態(tài)。見圖5A?；ㄆ焖伤?0、100 μM組E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，N-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖5B、5C。

2.6 花旗松素對(duì)SGC-7901細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與對(duì)照組相比較，花旗松素50、100 μM組SOD、GSH-Px活性均顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)。見圖6。

注：1對(duì)照組 2花旗松素25 μM組 3花旗松素50 μM組 4花旗松素100 μM組 與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.7 花旗松素對(duì)p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38MAPK)活化的影響 與對(duì)照組相比較，花旗松素50、100 μM組p38 MAPK磷酸化水平均顯著降低(P<0.05)。見圖7。

3 討論

近年來，隨著中醫(yī)藥的不斷探索，天然膳食提取物作為一種附加的治療策略，在癌癥治療中表現(xiàn)出獨(dú)特的吸引力，主要是因?yàn)樗鼈內(nèi)菀撰@得，毒性低，在人體中耐受性好[14]?；ㄆ焖伤厥撬煽浦参镏谐Ｒ姷狞S酮類化合物，存在于洋蔥，水飛薊，法國海洋樹皮和花旗松樹皮中[15]。本文研究結(jié)果表明，不同濃度花旗松素處理后，SGC-7901細(xì)胞存活率以花旗松素濃度依賴的方式降低。因此，選擇無顯著毒性的花旗松素濃度 (0、5、10、20 μM) 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

癌細(xì)胞無限增殖是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。研究[16]發(fā)現(xiàn)，花旗松素處理可降低ki-67的表達(dá)，導(dǎo)致乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞存活率和增殖能力下降。同樣，用花旗松素處理可以呈劑量依賴性的抑制人皮膚鱗癌細(xì)胞增殖[6]。本文研究結(jié)果表明，不同濃度花旗松素處理后，SGC-7901細(xì)胞EDU陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，提示花旗松素可通過抑制胃癌細(xì)胞增殖來影響胃癌的發(fā)生發(fā)展。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是治療胃癌的必要方式之一。研究[6]發(fā)現(xiàn)，花旗松素治療可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制瘢痕細(xì)胞癌的生長。Razak等[17]對(duì)人類結(jié)直腸癌HCT116和HT29細(xì)胞使用花旗松素會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯，在細(xì)胞周期的G2期控制細(xì)胞周期的分子變化和濃度依賴性的凋亡。本文研究結(jié)果表明，不同濃度花旗松素處理后，SGC-7901細(xì)胞細(xì)胞凋亡率降低，與上述研究結(jié)果一致。提示花旗松素可通過誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長。

惡性腫瘤細(xì)胞向周圍正常組織浸潤和侵襲是導(dǎo)致腫瘤快速增長和蔓延的主要原因，且胃癌細(xì)胞的侵襲與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程密切相關(guān)[18]。Vimentin是一種中間絲蛋白，與肺、前列腺和乳腺癌等大多數(shù)實(shí)體腫瘤類型的轉(zhuǎn)移潛能增加相關(guān)[19]。由于Vimentin對(duì)于細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性、層狀體的形成和粘附信號(hào)傳導(dǎo)是不可或缺的，下調(diào)Vimentin的表達(dá)足以改變細(xì)胞的體外形態(tài)以及抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲[20]。VEGF是血管生成的關(guān)鍵調(diào)控因子，是大多數(shù)癌細(xì)胞合成和分泌的，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[21]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在胃癌組織和細(xì)胞中均表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)的降低和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-cadherin、Vimentin的過表達(dá)[22]。研究[16]發(fā)現(xiàn)，花旗松素治療對(duì)MDA-MB-231和4T1乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力均有劑量依賴性的抑制作用?；ㄆ焖伤刂委熆赡芡ㄟ^PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制SSCC癌細(xì)胞的增殖和侵襲[6]。本文研究結(jié)果表明，不同濃度花旗松素處理后，SGC-7901細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)減少，EMT形態(tài)學(xué)變化受到抑制，E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，VEGF、Vimentin和N-cadherin的蛋白表達(dá)水平降低，提示花旗松素可抑制胃癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。

GSH-Px和SOD是細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑，MDA是脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)，兩者都在細(xì)胞氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。GSH-Px的消耗由于清除活性氧的損害而導(dǎo)致氧化損傷，SOD可以中和自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[23]。研究[24]證實(shí)，花旗松素能提高SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，具有增強(qiáng)抗氧化酶活性和抑制自由基過氧化的心臟保護(hù)作用。本文研究結(jié)果表明，不同濃度花旗松素處理后，SGC-7901細(xì)胞SOD活性和GSH-Px水平降低，MDA水平升高。提示花旗松素可抑制SGC-7901細(xì)胞的氧化應(yīng)激。

在細(xì)胞水平上，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族是細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要橋梁，在MAPK家族中，p38激酶在各種疾病中被發(fā)現(xiàn)改變，包括癌癥，這些激酶發(fā)揮基本作用，有時(shí)具有拮抗作用機(jī)制[25]。相關(guān)研究[26]表明p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡密切相關(guān)，p-P38對(duì)腫瘤的形成有負(fù)向調(diào)控作用。p38 MAPK信號(hào)通路也可影響 EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括E-cadherin和波形蛋白，表明p38 MAPK信號(hào)通路可調(diào)節(jié)EMT[27]。本文研究結(jié)果表明，不同濃度花旗松素處理后，p38 MAPK磷酸化水平降低。

綜上所述，花旗松素可抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞生長和運(yùn)動(dòng)并誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，這可能是通過抑制p38 MAPK的活化實(shí)現(xiàn)的。本文為花旗松素應(yīng)用于臨床治療胃癌提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，下一步計(jì)劃加入p38 MAPK信號(hào)通路抑制劑驗(yàn)證花旗松素對(duì)胃癌細(xì)胞的抗腫瘤作用。