張明明，馬衛(wèi)賓,2，王 沖，謝巖黎*

1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001 2.河南省糧油食品安全檢測與控制重點(diǎn)實(shí)驗室，河南 鄭州 450001

黃曲霉菌(Aspergillusflavus)是糧油儲藏中常見致病菌之一，能產(chǎn)生毒性極強(qiáng)的次級代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)，對人和動物的肝臟有致癌、致畸和致突變性[1]，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)定為Ⅰ類致癌物[2]。黃曲霉菌極易在糧食的播種、收獲、運(yùn)輸及儲藏過程中污染農(nóng)作物，尤其是花生、玉米等油料作物[3]，不僅會造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，還能通過黃曲霉毒素在食物鏈中積累引起嚴(yán)重的食品安全問題，最終危害人類健康[4]。我國作為糧食生產(chǎn)和消費(fèi)大國，致力于尋找安全高效的方法控制黃曲霉菌污染，以保障糧食安全和食品安全[5]。

目前普遍使用人工合成殺菌劑控制產(chǎn)毒真菌，但由于其降解時間長、有毒物殘留和對人類健康有潛在影響，因此國內(nèi)外研究者開始致力于從天然化合物中尋找安全、高效、經(jīng)濟(jì)且環(huán)境友好的新型抑菌物質(zhì)替代傳統(tǒng)防腐劑。目前已鑒定出多種天然抑菌物質(zhì)，主要存在于植物香料中，一些植物精油或成分(如姜黃精油[6]、孜然精油[7])已經(jīng)被開發(fā)成為食品抑菌劑。天然酚類香料也主要來源于植物，成分相對安全，在改善食品風(fēng)味的同時，還可發(fā)揮殺菌、防腐的作用[8]，在20世紀(jì)初被作為防腐劑添加在食品中。多數(shù)酚類香料被報道具有較好的抑菌活性，如丁香酚[9-10]、香芹酚[11]和百里香酚[12]等。Payne等[13]發(fā)現(xiàn)特丁基對苯二酚(TBHQ)和對羥基苯甲酸丙酯對李斯特菌的抑制效果都明顯高于常用食品抗菌劑山梨酸鉀。孫潔雯等[14]報道了23種酚類香料對4種常見細(xì)菌的抑菌活性，其中2-丙基苯酚、2-異丙基苯酚、4-丙基苯酚、香芹酚和百里香酚對4種供試細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑菌效果。然而關(guān)于4-丙基苯酚對黃曲霉菌的熏蒸抑菌活性未見有研究報道。4-丙基苯酚是GB 2760—2014中允許添加的食品香料，在食用安全性方面具有明顯優(yōu)勢。

本文以常用防腐劑山梨酸為陽性對照，篩選了國家標(biāo)準(zhǔn)中允許使用的7種酚類食品香料并對活性較好的4-丙基苯酚進(jìn)行了研究，進(jìn)一步分析其對黃曲霉菌的抑菌活性以及在花生儲藏中的應(yīng)用效果，為開發(fā)安全、高效的天然防腐劑或糧食防霉劑提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2-丙基苯酚、4-丙基苯酚、2-異丙基苯酚、茶多酚、百里香酚、麥芽酚、乙基麥芽酚等酚類食品香料：上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇(分析純)：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；吐溫80(化學(xué)純)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；黃曲霉菌(CGMCC 3.6304)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

沙氏培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、瓊脂20 g、葡萄糖40 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；XK96-A/B快速混勻器：江蘇新康醫(yī)療器械有限公司；DHP-9052 電熱恒溫培養(yǎng)箱：河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-20 雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化及孢子懸浮液的制備

將黃曲霉菌接種于沙氏培養(yǎng)基上，(28±2)℃培養(yǎng)7 d，使用含0.1%吐溫80的生理鹽水洗脫并通過3層擦鏡紙過濾菌絲得到孢子懸浮液[15]，采用血球計數(shù)板計數(shù)黃曲霉菌孢子，將孢子懸浮液濃度調(diào)整至106～108個/mL。

1.3.2 帶藥培養(yǎng)基法測定抑菌活性

參考Li等[16]使用的方法并稍做修改。根據(jù)設(shè)定濃度梯度，稱取相應(yīng)質(zhì)量的酚類化合物，加入含10%吐溫80的乙醇溶液(吐溫80與無水乙醇體積比1∶9)中渦旋混勻，制成化合物母液。吸取1 mL母液滴加到無菌培養(yǎng)皿中與19 mL滅菌沙氏培養(yǎng)基混勻，冷凝后備用，吸取3 μL黃曲霉菌孢子懸浮液(108個/mL)接種至培養(yǎng)基中間，在(28±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。酚類香料篩選質(zhì)量濃度為0.2、0.4 mg/mL。選4-丙基苯酚質(zhì)量濃度為0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mg/mL研究其最小抑菌濃度。未經(jīng)酚類香料處理的培養(yǎng)皿(20 mL滅菌培養(yǎng)基)作為空白對照(CK)。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，十字交叉法測量真菌生長直徑。計算黃曲霉菌生長抑制率。

生長抑制率=(dc-dt)/dc×100%，

式中：dc、dt分別為對照組和試驗組中黃曲霉菌生長平均直徑，cm。

1.3.3 密閉熏蒸法測定4-丙基苯酚抑菌活性

參考 Boukaew等[17]使用的方法，在培養(yǎng)皿中倒入20 mL滅菌的沙氏培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷凝后，吸取3 μL黃曲霉菌孢子懸浮液滴在培養(yǎng)基中間，將4-丙基苯酚添加到培養(yǎng)皿蓋內(nèi)側(cè)的滅菌濾紙條上迅速密封，其在培養(yǎng)皿內(nèi)的熏蒸質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL(化合物質(zhì)量/培養(yǎng)皿內(nèi)空氣體積)。(28±2)℃培養(yǎng)6 d，抑菌活性測定方法同1.3.2。

1.3.4 4-丙基苯酚對儲藏花生中黃曲霉菌的熏蒸抑菌活性

參考Prakash等[18]使用的方法，挑選顆粒飽滿無霉菌污染的花生，75%酒精浸泡30 s，用無菌水漂洗4次去掉殘留酒精。再將花生在黃曲霉菌孢子液中浸泡30 s，放置于超凈工作臺的無菌濾紙上，待其表面無殘留流動液體，平放到培養(yǎng)皿中備用(每皿10～12粒)。添加4-丙基苯酚于培養(yǎng)皿蓋內(nèi)側(cè)的滅菌濾紙上，熏蒸質(zhì)量濃度為0.2、0.5、0.8、1.1 mg/mL，滴加4-丙基苯酚后立即密封，(28±2)℃培養(yǎng)7 d。每個處理設(shè)置3個重復(fù)。每隔24 h，統(tǒng)計花生污染黃曲霉數(shù)量?；ㄉ棺兟?污染的花生數(shù)量/花生總數(shù)量×100%。

1.3.5 4-丙基苯酚對儲藏花生中黃曲霉菌的熏蒸殺菌活性

按照1.3.4方法準(zhǔn)備花生樣品，使無菌濾紙片上4-丙基苯酚的熏蒸濃度為0.8、1.1、1.4、1.7 mg/mL，(28±2)℃培養(yǎng)24 h后將花生移到新的滅菌培養(yǎng)皿中，密封后繼續(xù)培養(yǎng)6 d。每隔24 h記錄花生霉變數(shù)量，并計算霉變率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用 Origin 8.5和SPSS 20.0進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 7種酚類香料對黃曲霉菌生長的抑制活性

由表1可知，除麥芽酚外，大多數(shù)酚類香料對黃曲霉菌有不同的抑制效果。在0.2 mg/mL篩選質(zhì)量濃度下，乙基麥芽酚、茶多酚、麥芽酚3種化合物抑菌率均為0%，4-丙基苯酚顯示出良好的抑菌效果，抑制率為54.10%，約為陽性對照山梨酸(22.90%)的2倍。供試化合物在0.4 mg/mL時，抑制率較0.2 mg/mL時均有所升高，4-丙基苯酚、2-異丙基苯酚和2-丙基苯酚對黃曲霉菌的抑制效果最強(qiáng)，抑制率均為100%；其次是百里香酚，抑制率為90.10%；作為陽性對照，山梨酸的抑制率為60.10%；乙基麥芽酚和茶多酚的抑菌活性較弱，抑制率分別為23.30%和1.80%。抑菌活性篩選結(jié)果表明，供試的7種酚類食品香料中，4-丙基苯酚的抑菌效果最好，且明顯優(yōu)于陽性對照山梨酸。

表1 7種酚類香料對黃曲霉菌生長的抑制活性(7 d)

2.2 4-丙基苯酚對黃曲霉菌的最小抑菌濃度

采用帶藥培養(yǎng)基法，通過研究不同質(zhì)量濃度4-丙基苯酚對黃曲霉菌絲生長的抑制作用，確定最小抑菌濃度。由圖1a可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，黃曲霉菌落直徑不斷增大。與CK組相比，4-丙基苯酚在不同質(zhì)量濃度下均可以延緩黃曲霉菌絲生長，且延緩程度呈濃度依賴性。質(zhì)量濃度為0.25、0.30 mg/mL時，菌絲延遲生長了2～5 d，且培養(yǎng)6 d的菌落直徑與CK組培養(yǎng)1 d的直徑大小相當(dāng)。濃度為0.35、0.40 mg/mL時，培養(yǎng)期間未見黃曲霉菌生長。

由圖1b可知，4-丙基苯酚對黃曲霉生長的抑制效果呈劑量依賴性。當(dāng)4-丙基苯酚質(zhì)量濃度為0.20～0.30 mg/mL時，對黃曲霉的生長有不同程度的抑制作用，抑制率為54.1%～90.6%；當(dāng)質(zhì)量濃度繼續(xù)增大到0.35 mg/mL及以上時，可完全抑制黃曲霉菌絲生長，抑制率達(dá)100%，由此可知4-丙基苯酚對黃曲霉的MIC為0.35 mg/mL。

2.3 4-丙基苯酚對黃曲霉菌的熏蒸抑制作用

由圖2a可知，與CK組相比，密閉熏蒸條件下不同質(zhì)量濃度的4-丙基苯酚對黃曲霉菌絲生長均具有一定的抑制作用，且隨著熏蒸質(zhì)量濃度的增大，對黃曲霉生長的抑制作用逐漸增強(qiáng)。在0.02、0.03 mg/mL質(zhì)量濃度下，與CK組相比，菌絲生長延遲了1 d；0.04、0.05 mg/mL處理時，連續(xù)培養(yǎng)6 d黃曲霉菌落直徑為0，其生長完全被抑制。

由圖2b可知，4-丙基苯酚對黃曲霉的熏蒸抑制作用與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。在0.01、0.02、0.03 mg/mL質(zhì)量濃度下的抑制率分別為14.4%、38.8%和91.6%；4-丙基苯酚質(zhì)量濃度達(dá)到0.04 mg/mL及以上時，黃曲霉生長完全被抑制。由此可見，熏蒸條件下4-丙基苯酚對黃曲霉菌的MIC為0.04 mg/mL。此外，與帶藥培養(yǎng)基試驗結(jié)果相比，4-丙基苯酚在密閉熏蒸法中可在較低濃度下抑制黃曲霉生長，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑菌效果，其原因可能與供試化合物在熏蒸條件下對微生物細(xì)胞具有更強(qiáng)的滲透作用有關(guān)[19]。

2.4 4-丙基苯酚對儲藏花生中黃曲霉菌生長的熏蒸抑制作用

由圖3a可知，不同質(zhì)量濃度的4-丙基苯酚對儲藏花生中的黃曲霉菌有一定的熏蒸抑制效果，且呈劑量依賴性。隨著花生的儲藏時間延長，霉變率不斷升高；同時隨著4-丙基苯酚質(zhì)量濃度的升高，黃曲霉菌對花生的污染率出現(xiàn)不同程度的降低，7 d時，在0.2、0.5、0.8 mg/mL質(zhì)量濃度下，花生霉變率分別為100%、72.7%、18.2%；1.1 mg/mL質(zhì)量濃度下，花生的黃曲霉菌污染率為0%。圖3b為4-丙基苯酚抑制黃曲霉菌污染花生的實(shí)物圖，由圖3b可以看出，4-丙基苯酚能有效抑制黃曲霉菌的生長，熏蒸質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時，花生上的黃曲霉菌明顯變少，達(dá)到1.1 mg/mL時，花生上的黃曲霉菌生長完全被抑制，表明4-丙基苯酚熏蒸處理對儲藏中花生的MIC為1.1 mg/mL。

2.5 4-丙基苯酚對儲藏花生中黃曲霉菌生長的熏蒸殺菌活性

由圖4a可知，4-丙基苯酚對花生中黃曲霉菌的污染具有顯著的抑制效果。4-丙基苯酚熏蒸質(zhì)量濃度為0.8、1.4 mg/mL時，儲藏前熏蒸處理24 h能夠在一定程度上延遲黃曲霉菌對花生的侵染，與CK相比可延遲1～2 d。質(zhì)量濃度達(dá)到1.7 mg/mL時，儲藏期間花生未發(fā)生霉變，表明在此質(zhì)量濃度下熏蒸24 h可將花生上的黃曲霉菌孢子完全殺死，有效防止黃曲霉菌在花生上的侵染和生長。圖4b為4-丙基苯酚熏蒸處理對花生中黃曲霉菌的殺菌效果實(shí)物圖，可以看出，隨著4-丙基苯酚質(zhì)量濃度的增加，花生霉變率開始下降；當(dāng)達(dá)到1.7 mg/mL時，可以完全抑制黃曲霉菌在花生上的生長，表明4-丙基苯酚熏蒸24 h對儲藏花生中黃曲霉菌的MFC為1.7 mg/mL。

3 結(jié)論

本文研究了7種酚類食品香料對黃曲霉菌的抑制效果，通過帶藥培養(yǎng)基法的篩選，多數(shù)酚類香料表現(xiàn)出一定的抑菌活性，其中4-丙基苯酚效果最好，且明顯優(yōu)于陽性對照山梨酸。在此基礎(chǔ)上，通過接觸和熏蒸2種方式進(jìn)一步研究了4-丙基苯酚在不同質(zhì)量濃度下的抑菌效果，結(jié)果顯示4-丙基苯酚在接觸和熏蒸的條件下對黃曲霉生長的MIC分別為0.35 mg/mL和0.04 mg/mL，表明在熏蒸條件下對黃曲霉菌具有更好的抑制效果。此外，研究 4-丙基苯酚對花生儲藏中黃曲霉菌污染的控制效果時發(fā)現(xiàn)熏蒸質(zhì)量濃度為1.1 mg/mL時，4-丙基苯酚能夠完全抑制黃曲霉菌孢子在花生上的侵染，1.7 mg/mL熏蒸24 h可將花生上的黃曲霉菌孢子完全殺死。因此，4-丙基苯酚對花生儲藏中的黃曲霉菌污染具有很好的控制作用，有望開發(fā)成一種新型、安全、環(huán)保的糧食防霉劑或食品防腐劑，拓寬了其在食品中的應(yīng)用范圍和用途。目前關(guān)于酚類香料的抑菌機(jī)理尚不明確，Shen等[20]發(fā)現(xiàn)百里香酚處理能夠誘導(dǎo)黃曲霉菌孢子產(chǎn)生過量的ROS和NO，最終導(dǎo)致黃曲霉死亡。此外，Dambolena等[21]指出親脂性是酚類化合物抗真菌活性的關(guān)鍵特性，且酚類抗菌劑的作用機(jī)理與引起細(xì)胞膜受損以及營養(yǎng)物質(zhì)滲漏從而導(dǎo)致微生物死亡有關(guān)。4-丙基苯酚具有開發(fā)成為天然、環(huán)保、安全的防腐防霉劑的潛力，目前還未有其抑菌機(jī)理的相關(guān)報道，值得進(jìn)一步深入研究。