丁明雅，張雅倩，楊玉喬，李晉，何俊，常艷旭

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

中藥標(biāo)準(zhǔn)飲片是按照一定的技術(shù)規(guī)范制成，能體現(xiàn)中藥整體性和專(zhuān)屬性的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)形式，是衡量中藥飲片質(zhì)量最合適的“標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)”[1]。當(dāng)前可以被用作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的化學(xué)對(duì)照品、對(duì)照藥材及對(duì)照提取物仍無(wú)法反映中藥飲片的科學(xué)內(nèi)涵和特征屬性[2]。中國(guó)藥典中中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)多數(shù)參考藥材的標(biāo)準(zhǔn)，缺乏專(zhuān)屬性和客觀性。因此建立中藥飲片專(zhuān)屬標(biāo)準(zhǔn)，健全中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)體系是及其必要的。通常來(lái)說(shuō)標(biāo)準(zhǔn)飲片質(zhì)量均勻是其質(zhì)量穩(wěn)定的重要表現(xiàn)[3-4]。標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化研究可確保中藥臨床用藥的安全性和有效性，為建立健全中藥標(biāo)準(zhǔn)體系提供基礎(chǔ)性研究方案。

南葶藶子為十字花科植物播娘蒿Descurainia sophia（L．）Webb ex Prantl．的干燥成熟種子，其最早記錄在《神農(nóng)本草經(jīng)》中。南葶藶子有下氣行水、清熱活血、利尿消腫[5-6]的功效。主治痰液積聚，咳嗽痰多，呼吸困難，胸腹水腫等癥。南葶藶子中化學(xué)成分主要有強(qiáng)心苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、脂肪油類(lèi)及有機(jī)酸類(lèi)等[7-9]，其對(duì)呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)疾病的治療都具有積極作用[10-11]。但有關(guān)南葶藶子及炒南葶藶子制備標(biāo)準(zhǔn)飲片的相關(guān)報(bào)道較少。開(kāi)展南葶藶子及炒南葶藶子標(biāo)準(zhǔn)飲片制備研究有利于其市場(chǎng)質(zhì)量監(jiān)管，其標(biāo)準(zhǔn)飲片的均勻化方法研究同時(shí)有利于保障飲片安全性、有效性和質(zhì)量可控性[1，12-14]。本文以出粉率、3種黃酮類(lèi)化合物的總含量及指紋圖譜峰總面積為指標(biāo)，考察了粉碎時(shí)間、粉碎次數(shù)、投料量對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化方法的影響[12-14]，優(yōu)化南葶藶子及炒南葶藶子粉碎工藝，為南葶藶子和炒南葶藶子標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化技術(shù)規(guī)范的制定提供了參考依據(jù)。

1 儀器和試劑

1.1 儀器 Waters ACQUITY超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；AX205型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；小型粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；SB-1000YDTD型超聲清洗槽（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Mill-Q II型超純水器（Millipore公司）；3K15型離心機(jī)（半徑11 cm，德國(guó)Sigma公司）；XW-80A型旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠）。

1.2 試劑 乙腈來(lái)自Merk公司、甲醇來(lái)自Fisher公司、甲酸來(lái)自Tedia公司，所有有機(jī)試劑均為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水均由Millipore超純水系統(tǒng)制得。

2 藥品與方法

2.1 藥材與標(biāo)準(zhǔn)品 南葶藶子和炒南葶藶子藥材于2016年購(gòu)買(mǎi)于安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)馬琳教授鑒定為十字花科植物播娘嵩Descurainia sophia（L．）Webb．ex Prantl．的干燥成熟種子，并按照2015版藥典進(jìn)行凈制和炮制，獲得南亭藶子飲片和炒葶藶子飲片。所有樣品干燥24 h后，在規(guī)定目數(shù)篩子下篩分備用（干燥溫度：60℃；篩子：65目）。黃酮類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷（批號(hào)：PCS0375）、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（批號(hào)：CHB160912）、異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖（批號(hào)：PS14012301）均來(lái)自德思特生物科技有限公司（成都），高效液相分析純度均≥98%。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)采用設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)表（表1），考察粉碎時(shí)間（A）、粉碎次數(shù)（B）和投料量（C）均對(duì)飲片出粉率有影響。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

2.3 3種黃酮成分含量測(cè)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 3種黃酮類(lèi)成分分別加甲醇制成質(zhì)量濃度均為1．00 mg/mL的對(duì)照品母液。分別精密量取各母液適量配制成濃度分別為500 μg/mL（槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖）、50 μg/mL（槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）、50 μg/mL（異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照一定比例向下逐級(jí)稀釋成所需濃度，備用。

2.3.2 樣品的制備 精密稱(chēng)取0．750 g樣品粉末于錐形瓶中，超聲30 min進(jìn)行樣品提?。ㄌ崛∪軇?0%的甲醇，10 mL），超聲前后對(duì)具塞錐形瓶總質(zhì)量進(jìn)行稱(chēng)質(zhì)量，用提取溶液補(bǔ)足質(zhì)量差，混勻后14 000 rpm離心10 min，離心半徑為8 cm，取上清，經(jīng)0．22 μm針式過(guò)濾器過(guò)濾后進(jìn)樣分析[15]。

2.3.3 色譜條件色譜柱：ACQUITYBEHC18（1．7μm，2．1×100mm）；保護(hù)柱：Waters C18柱（2．1 mm×12．5 mm，5 μm）；流速：0．3 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：30 ℃；波長(zhǎng)掃描：265 nm；檢測(cè)時(shí)間：16 min；流動(dòng)相：含0．1%甲酸的水溶液（A）- 乙腈（B）；采用梯度洗脫。見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫程序表Tab.2 Gradient elution procedure

2.3.4 出粉率的測(cè)定 對(duì)已稱(chēng)質(zhì)量樣品粉末進(jìn)行粉末化處理，粉碎盡可能完全，過(guò)4號(hào)篩（65目），分離粉末和藥渣，計(jì)算出粉率。

3 結(jié)果

3.1 單因素考察 以出粉率為指標(biāo)，考察了飲片投料量、打粉時(shí)間、打粉次數(shù)對(duì)飲片粉碎工藝的影響。研究結(jié)果表明，當(dāng)南葶藶子投料量為100 g和150 g時(shí)，飲片出粉率沒(méi)有明顯差異，綜合考慮以150 g投料量為最佳，出粉率為74．0%?？疾觳煌蚍蹠r(shí)間（10 s、20 s、30 s）對(duì)粉碎工藝的影響，結(jié)果顯示單次打粉20 s出粉率最高，為72．8%?？疾齑蚍鄞螖?shù)（2次、3次、4次）對(duì)粉碎工藝的影響，發(fā)現(xiàn)打粉4次時(shí)飲片出粉率較其他組高，為83%。因此，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了南葶藶子最佳粉碎工藝為：投料量150 g，打粉4次，單次打粉時(shí)間20 s。按照相同的方法，確定了炒南葶藶子最佳粉碎工藝為：投料量100 g，打粉4次，單次打粉時(shí)間20 s。

3.2 3個(gè)黃酮類(lèi)化合物的含量測(cè)定

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 將配置好的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇逐級(jí)稀釋成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣分析，按橫、縱坐標(biāo)分別為濃度（μg/mL）和峰面積進(jìn)行線性擬合，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 3種黃酮類(lèi)成分的線性回歸方程Tab.3 Linearity and regression equations of three flavonoids

3.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一批供試品溶液于1日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示3種黃酮類(lèi)化合物6次進(jìn)樣峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）分別為1．38%、0．40%、0．84%，表明儀器精密度良好。

3.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取適量供試品溶液，分別于1日內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣分析，加樣第1個(gè)點(diǎn)設(shè)置為0 h，依次按照選取的時(shí)間間隔進(jìn)樣分析供試樣品，共記錄24 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后依次計(jì)算供試品溶液中3個(gè)黃酮類(lèi)化合物在不同時(shí)間點(diǎn)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示3個(gè)化合物連續(xù)24 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣峰面積 RSD 分別為：1．43%、1．87%、2．06%，表明樣品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批次南葶藶子樣品粉末，平行制備6份樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣分析。計(jì)算所得峰面積換算成化合物濃度，分別計(jì)算6份樣品中3種黃酮類(lèi)化合物的含量，結(jié)果顯示3種黃酮類(lèi)化合物含量的RSD值分別為 3．72%、4．92%、3．82%，說(shuō)明供試品樣品處理方法重復(fù)性良好。

3.2.5 指紋圖譜測(cè)定 取正交實(shí)驗(yàn)9份樣品粉末，分別檢測(cè)指紋圖譜，計(jì)算UPLC指紋圖譜峰面積大于3 000的指紋峰總面積結(jié)果見(jiàn)表4[18]。南葶藶子生品與炮制品指紋圖譜結(jié)果分別見(jiàn)圖1和圖2。并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)其共有指紋峰進(jìn)行比對(duì)，指認(rèn)了其中5個(gè)色譜峰分別為槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖、芥子酸和異鼠李素（圖3B）。

表4 南葶藶子和炒南葶藶子樣品L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Tab.4Results for orthogonal test L9（34）of raw and stir-fried Descurainiae Semen

圖1 南葶藶子樣品超高效液相色譜指紋圖譜Fig.1 Ultra high-performance liquid chromatography fingerprint of Descurainiae Semen

圖2 炒南葶藶子樣品UPLC指紋圖譜Fig.2 Ultra high-performance liquid chromatography fingerprint of stir-fried Descurainiae Semen

圖3 典型色譜圖譜Fig.3 Typical chromatography

3.3 3個(gè)黃酮類(lèi)化合物的總含量測(cè)定 按照正交實(shí)驗(yàn)計(jì)算出的9組制備工藝分別制備南葶藶子及炒南葶藶子樣品粉末，采用UPLC法測(cè)各組樣品粉末中所含3種黃酮類(lèi)化合物的總含量。按照上述色譜條件進(jìn)樣分析南葶藶子及混合對(duì)照品典型色譜圖見(jiàn)圖3。

3.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4.1 綜合評(píng)分法分析正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)采用加權(quán)法對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分，選用出粉率（D）、3個(gè)黃酮類(lèi)化合物的總含量（E）、指紋圖譜總峰面積（F）作為均勻化方法考察的指標(biāo)，根據(jù)所測(cè)指標(biāo)在南葶藶子飲片均勻化工藝中的主次順序確定各指標(biāo)權(quán)重[17]，系數(shù)分別為：0．3、0．4、0．3。

3.4.2 數(shù)據(jù)處理與分析 南葶藶子及炒南葶藶子綜合評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。南葶藶子和炒南葶藶子方差分析結(jié)果顯示粉碎時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小。在α=0．05條件下，粉碎時(shí)間、粉碎次數(shù)和投料量對(duì)粉碎工藝沒(méi)有顯著性的影響可能是因素間交互作用或誤差自由度小的原因。因此，根據(jù)直觀分析結(jié)果，影響南葶藶子飲片均勻化因素的主次順序?yàn)椋篊（投料量）＞B（粉碎次數(shù)）＞A（粉碎時(shí)間），A2＞A3＞A1，B3＞B1＞B2，C2＞C1＞C3。為節(jié)省生產(chǎn)成本，最佳均勻化方法選擇A1B3C2，即用150 g南葶藶子飲片，粉碎4次，每次10 s。同理直觀分析結(jié)果顯示，影響炒南葶藶子綜合評(píng)分因素的主次順序?yàn)椋築（粉碎次數(shù)）＞C（投料量）＞A（粉碎時(shí)間），A2＞A3＞A1，B2＞B3＞B1，C1＞C3＞C2。綜合考慮，最佳均勻化方法為A1B2C1，即用100 g炒南葶藶子飲片，粉碎3次，每次10 s。

表5 南葶藶子和炒南葶藶子標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化粉碎工藝方差分析結(jié)果Tab.5 Analysis of variance of homogenization crushing process of standard decoction pieces of raw and stir-fried Descurainiae Semen

3.4.3 南葶藶子和炒南葶藶子最佳均勻化工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)所得的最優(yōu)均勻化工藝對(duì)南葶藶子及炒南葶藶子樣品進(jìn)行粉碎，實(shí)驗(yàn)平行3次，計(jì)算每份粉末的出粉率，并測(cè)定指紋圖譜總峰面積和3個(gè)黃酮類(lèi)化合物的總含量。最佳粉碎工藝驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 南葶藶子和炒南葶藶子最佳均勻化工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Tab.6 Verification test of optimal homogenization process of raw and stir-fried Descurainiae Semen

4 討論

中藥標(biāo)準(zhǔn)飲片處理是否均勻?qū)τ谒幬镄再|(zhì)、屬性的表達(dá)具有關(guān)鍵的作用，而粉碎工藝在標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化工藝中占絕對(duì)的比重，對(duì)粉碎工藝進(jìn)行研究是中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)制定的基礎(chǔ)也是必不可少的步驟。本文通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)中藥南葶藶子及其炮制品進(jìn)行粉碎均勻化研究，經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)最佳均勻化方法制備的樣品其不同測(cè)定指標(biāo)值均可以穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)，研究結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為南葶藶子標(biāo)準(zhǔn)飲片進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)性研究材料。

單一指標(biāo)通常會(huì)導(dǎo)致優(yōu)化結(jié)果的不準(zhǔn)確，多指標(biāo)優(yōu)化不僅避免單指標(biāo)優(yōu)化的缺陷，還可以較為合理地優(yōu)選南葶藶子及炒南葶藶子標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化方法，使研究更具有專(zhuān)屬性，說(shuō)服性[18-19]。本研究選擇3個(gè)關(guān)鍵考察指標(biāo)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化工藝進(jìn)行優(yōu)選，其中飲片出粉率反映了飲片的粉碎效率，通過(guò)調(diào)節(jié)粉碎過(guò)程的關(guān)鍵因素來(lái)實(shí)現(xiàn)出粉率最大化；本研究所選的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷3個(gè)含量測(cè)定的化合物是南葶藶子樣品中含量相對(duì)較高且又具有代表性的黃酮類(lèi)成分，將其作為南葶藶子藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分[20]；指紋圖譜可以較好地反映藥材中化合物信息，為飲片中化學(xué)成分系統(tǒng)的研究提供了研究方法，同時(shí)在265 nm波長(zhǎng)下測(cè)定的色譜峰響應(yīng)值高，出峰較多，各色譜峰之間分離度較好，保留時(shí)間適中，故選擇265 nm下總峰面積，更能相對(duì)全面地評(píng)價(jià)南葶藶子的飲片質(zhì)量[21]。研究選用多指標(biāo)優(yōu)化均勻化工藝不僅填補(bǔ)了研究空白，也為后期標(biāo)準(zhǔn)飲片相關(guān)質(zhì)量控制提供可資借鑒的案例。南葶藶子及炒南葶藶子標(biāo)準(zhǔn)飲片粉碎工藝研究，為中藥標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化技術(shù)研究提供支撐材料[22]。

5 結(jié)論

以出粉率、3個(gè)黃酮類(lèi)化合物的總含量、指紋圖譜總峰面積作為指標(biāo)，對(duì)投料量、單次粉碎時(shí)間、粉碎次數(shù)3個(gè)因素進(jìn)行考察，優(yōu)化南葶藶子和炒南葶藶子標(biāo)準(zhǔn)飲片的均勻化方法，確定南葶藶子最佳均勻化工藝：投料量150 g，單次粉碎時(shí)間10 s，粉碎4次；炒南葶藶子飲片最佳均勻化工藝：投料量100 g，單次粉碎時(shí)間10 s，粉碎3次。標(biāo)準(zhǔn)飲片均勻化研究確保了中藥臨床用藥的安全性和有效性，為建立健全中藥標(biāo)準(zhǔn)體系提供基礎(chǔ)性研究方案。