扈曉佳， 董思萱

(自然陽光(上海)日用品有限公司， 上海 200070)

葡萄(Vitisvinifera)是世界上栽培面積最廣的果樹作物，也是一種經(jīng)濟價值極高的作物。葡萄富含礦物質(zhì)、維生素及人體所需的氨基酸，隨著生物科技的發(fā)展，從葡萄中還相繼發(fā)現(xiàn)了多種具有抗氧化、消炎的天然活性物質(zhì)，如白藜蘆醇、齊墩果酸、花色苷和原花青素等，具有極高的保健價值[1]。阿薩伊果又稱巴西莓，是產(chǎn)于亞馬遜雨林地區(qū)的一種棕櫚樹的果實，于2013年被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品[2-4]。阿薩伊果含有的原花青素二聚體成分，能有效地抑制胰脂活性酶的活性，對人體具有降血脂的功效，幫助人體預(yù)防心腦血管疾病[5]。葡萄阿薩伊果混合飲料是自然陽光旗下的天然健康飲品，飲料中的水果精華萃取于阿薩伊果、白葡萄、紅葡萄、藍莓、蔓越莓等水果，含有人體健康所需的花青素、不飽和脂肪酸、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)。其主要功能物質(zhì)包含花青素及原花青素糖苷類、黃酮類物質(zhì)[6-8]，具有抗菌、抗氧化、消炎、抗疲勞、保護肝臟等多種藥理作用[9-11]。目前對葡萄阿薩伊果混合飲料抗炎活性的研究報道仍較少。

斑馬魚作為一種新的模式動物，具有體積小、費用低、實驗周期短的特點[12]。目前在食品、活性部位篩選、安全性評價以及藥物代謝等中藥相關(guān)實驗中應(yīng)用廣泛。脂多糖(LPS)是所有革蘭氏陰性菌的主要外膜成分，可激活中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞。斑馬魚受到LPS刺激后，啟動一系列細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致中性粒細(xì)胞活化并釋放促炎細(xì)胞因子[13-15]。本實驗采用脂多糖誘導(dǎo)法構(gòu)建斑馬魚炎癥模型，研究葡萄阿薩伊果混合飲料的最大檢測濃度及抗炎活性評價，以期為葡萄阿薩伊果混合飲料的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

受精后3 d的轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞熒光斑馬魚450尾，由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司養(yǎng)育中心(實驗動物使用許可證號為SYXK(浙)2021-0171)繁殖提供。葡萄阿薩伊果混合飲料由自然陽光(上海)日用品有限公司提供。吲哚美辛(批號：1108939)購自上海晶純實業(yè)有限公司。LPS(批號：12180309)購自Sigma公司。

解剖顯微鏡(SZX7，OLYMPUS，日本)，CCD相機(VertA1，上海土森視覺科技有限公司)，精密電子天平(CP214，OHAUS，美國)，電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡(AZ100，Nikon，日本)，甲基纖維素(Sigma，美國)，6孔板(Nest Biotech)。

1.2 方法

1.2.1 葡萄阿薩伊果混合飲料最大檢測濃度

將6孔板中330尾轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞熒光斑馬魚隨機分為11組，包括正常對照組、模型對照組、9個不同濃度葡萄阿薩伊果混合飲料實驗組，每組30尾。正常對照組為養(yǎng)育用水處理斑馬魚，模型對照組和實驗組則為用LPS以卵黃囊注射方式處理斑馬魚，建立斑馬魚炎癥模型。模型建立成功后，實驗組給予系列濃度(3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、250、500和1 000 μL·mL-1)的葡萄阿薩伊果混合飲料，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，考察葡萄阿薩伊果混合飲料不同濃度組的斑馬魚的死亡數(shù)量，確定葡萄阿薩伊果混合飲料最大檢測濃度。

1.2.2 葡萄阿薩伊果混合飲料的抗炎作用

將6孔板中120尾斑馬魚隨機分為4組，包括正常對照組、模型對照組、吲哚美辛組和葡萄阿薩伊果混合飲料組，每孔每組30尾。模型建立成功后，陽性對照組給予80 μmol·L-1的吲哚美辛，實驗組給予15.6 μL·mL-1的葡萄阿薩伊果混合飲料。將各組斑馬魚置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，每組隨機選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計算斑馬魚炎癥中性粒細(xì)胞個數(shù)。以斑馬魚炎癥中性粒細(xì)胞個數(shù)評價葡萄阿薩伊果混合飲料對LPS誘發(fā)斑馬魚模型的抗炎活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄阿薩伊果混合飲料最大耐受劑量的確定

在進行功效評價之前，考察斑馬魚對不同濃度的葡萄阿薩伊果混合飲料的最大耐受劑量。葡萄阿薩伊果混合飲料在3.9～15.6 μL·mL-1濃度時，斑馬魚無死亡現(xiàn)象，也無明顯形態(tài)行為異常和毒副作用。在31.25 μL·mL-1濃度時，6.67%(2/30尾)斑馬魚被誘發(fā)心包水腫，10%(3/30尾)斑馬魚出現(xiàn)身體彎曲現(xiàn)象。在62.5～1 000 μL·mL-1濃度范圍內(nèi)，葡萄阿薩伊果混合飲料誘發(fā)100%(30/30尾)斑馬魚死亡。因此，后續(xù)的功效評價中，葡萄阿薩伊果混合飲料的最佳實驗濃度確定為15.6 μL·mL-1(表1)。

表1 斑馬魚對不同濃度葡萄阿薩伊果混合飲料的耐受情況

2.2 葡萄阿薩伊果混合飲料抗炎作用評價

葡萄阿薩伊果混合飲料對中性粒細(xì)胞在斑馬魚尾鰭傷口處聚集的影響如圖1和表2所示。模型對照組斑馬魚炎癥部位中性粒細(xì)胞個數(shù)(16)與正常對照組(3)相比顯著上升，而吲哚美辛組(80 μmol·L-1吲哚美辛)斑馬魚中性粒細(xì)胞個數(shù)與模型對照組比較顯著下降(圖2)，表明LPS誘發(fā)轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞炎癥模型構(gòu)建成功，同時也說明陽性藥吲哚美辛對斑馬魚中性粒細(xì)胞的聚集有顯著的抑制作用。葡萄阿薩伊果混合飲料濃度為15.6 μL·mL-1時，所對應(yīng)的斑馬魚尾鰭部位中性粒細(xì)胞個數(shù)為9，與模型對照組的細(xì)胞個數(shù)(16)相比顯著減少，炎癥消退作用為44%，略優(yōu)于陽性藥吲哚美辛組(38%)(圖3)。

***表示與模型對照組相比P<0.001。圖3 同。

圖3 葡萄阿薩伊果混合飲料組與吲哚美辛組對斑馬魚炎癥消退作用比較

表2 葡萄阿薩伊果混合飲料對斑馬魚的炎癥保護作用

圖1 各組斑馬魚炎癥部位中性粒細(xì)胞聚集情況(紅色區(qū)域為炎癥部位中性粒細(xì)胞)

3 小結(jié)與結(jié)論

炎癥是機體對外來生物的一系列綜合生理反應(yīng)，包括人類病原體、灰塵顆粒和病毒等，是機體清除病原體和組織修復(fù)的一部分[16]。當(dāng)炎癥發(fā)生時會產(chǎn)生各種炎癥介質(zhì)，包括趨化因子、細(xì)胞因子、血管活性胺、類二十烷酸和蛋白水解級聯(lián)產(chǎn)物，從而在局部引發(fā)炎癥滲出物[17]。此時，血管中的血漿蛋白和白細(xì)胞(主要是中性粒細(xì)胞)可以通過毛細(xì)血管后小靜脈進入血管外組織，向炎癥部位遷移和聚集[18]，當(dāng)它們到達受影響的組織部位時，中性粒細(xì)胞通過與病原體的直接接觸或通過組織駐留細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的作用而被激活[19]。激活的中性粒細(xì)胞試圖通過釋放有毒成分來殺死病原體，這些成分包括活性氧和蛋白酶3、組織蛋白酶G和彈性蛋白酶[20]。研究表明，機體內(nèi)的病理過程大多與ROS的過量產(chǎn)生有關(guān)，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷或炎癥發(fā)生[21]。因此，中性粒細(xì)胞個數(shù)增多表明炎癥反應(yīng)和炎癥浸潤的發(fā)生，是評價藥物抗炎作用的重要指標(biāo)[22]。

有研究表明，葡萄和阿薩伊果中含有多種抗氧化成分，如花青素、黃酮和酚類成分，具有抗炎、抗氧化、抗高血壓和降糖降脂等多種生物活性[23-27]。Kim等[28]使用阿薩伊果提取物處理LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)阿薩伊果可以抑制IL-6、IL-8和PGE 2等細(xì)胞因子表達，從而控制炎癥反應(yīng)。Kang等[29]從阿薩伊果中分離了5種黃酮類化合物，發(fā)現(xiàn)其具有抑制NF-kB活化的抗炎作用。Carey等[30]通過體內(nèi)實驗表明，阿薩伊果干預(yù)后可以降低大鼠體內(nèi)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞一氧化氮和腫瘤壞死因子-α的表達。體外實驗顯示，阿薩伊果可以抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，其機制可能與抑制一氧化氮合成、抑制NF-kB有關(guān)[28]。

斑馬魚因其體積小、繁殖力高和基因組注釋完整等優(yōu)勢，成為最受重視的脊椎動物發(fā)育生物學(xué)模式動物之一，也是目前唯一適合進行微孔板高通量藥物篩選的脊椎類動物[31]。斑馬魚幼蟲的透明度允許炎癥細(xì)胞遷移的實時可視化，在炎癥反應(yīng)發(fā)生時，斑馬魚的主要白細(xì)胞是中性粒細(xì)胞，它們是最豐富的，也是最先到達受傷部位的細(xì)胞[32]。因此，本實驗采用了轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞熒光斑馬魚，可在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚體內(nèi)的中性粒細(xì)胞個數(shù)，直觀展示斑馬魚體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

本研究基于LPS誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞斑馬魚炎癥模型，發(fā)現(xiàn)15.6 μL·mL-1自然陽光葡萄阿薩伊果混合飲料對斑馬魚無明顯毒副作用，同時可以抑制LPS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞浸潤，發(fā)揮抗炎作用。結(jié)果顯示，斑馬魚模型中自然陽光葡萄阿薩伊果混合飲料組的炎癥應(yīng)激反應(yīng)較模型組顯著降低，效果略優(yōu)于陽性對照組。本研究通過斑馬魚炎癥模型驗證了葡萄阿薩伊果混合飲料的抗炎活性，為葡萄阿薩伊果混合飲料的研究和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。