劉寅，段毛毛

(1.吉林省吉林生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，吉林吉林 132001； 2.吉林化纖集團有限責(zé)任公司，吉林吉林 132001)

硝基苯類化合物主要用于化工、染料、炸藥和制革等工業(yè)，是一類污染范圍廣、危害性大的工業(yè)污染物[1]，其中硝基氯苯類在其制造流程中往往由于轉(zhuǎn)化不完全而隨廢物排放入環(huán)境水體中，從而造成地表水和地下水污染[2]，可經(jīng)皮膚吸收進入人體導(dǎo)致中毒，屬高毒類有機污染物[3]。

目前國內(nèi)監(jiān)測水中硝基苯類物質(zhì)的常見方法有氣相色譜法[4-6]、氣相色譜-質(zhì)譜法[7-9]、液相色譜法[10-11]和分光光度法[12-13]。分光光度法儀器價格低廉、便攜性較高，缺點是準確度差，且不同待測物組分間干擾較大，已逐漸式微[14]；氣相色譜法與氣相色譜-質(zhì)譜法測定硝基苯類時，樣品在進入儀器分析前需要經(jīng)過液液萃取或固相萃取(SPE)的富集式預(yù)處理步驟，且兩種方法樣品預(yù)處理均需要使用二氯甲烷，二氯甲烷雖本身毒性較低[15]，但在常溫下極易揮發(fā)，遇熱和潮濕可生成含有劇毒的光氣。氯化氫和一氧化碳反應(yīng)生成的混合腐蝕性煙霧，長期接觸對人危害較大[16]；高效液相色譜法可免除樣品預(yù)處理步驟，但未經(jīng)富集便直接測定會導(dǎo)致各待測物的檢出限較高，不利于痕量分析。

在線SPE 法是一種基于閥切換的自動化樣品前處理技術(shù)，與傳統(tǒng)SPE 法相比，具有所需樣品量較少、分析快速、操作簡便、重現(xiàn)性好、安全性高的優(yōu)點[17]。筆者采用在線固相萃取-高效液相色譜(SPE-HPLC)法測定水中硝基苯與5 種硝基氯苯類化合物。該方法的各目標物線性區(qū)間寬，精密度、準確度滿足分析要求，所需樣品量少、操作簡便、安全性高，適用于水中污染物的監(jiān)測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Dionex Ultimate3000 型，配置有VWD3000 型紫外檢測器及在線SPE 預(yù)處理功能模塊，SPE 定量環(huán)最大體積為2 500 μL，美國賽默飛世爾科技公司。

超純水機：Milli-Q Academic 型，美國默克公司。

乙酸纖維微孔濾膜：孔徑為0.45 μm。

甲醇中硝基苯、2-硝基氯苯、3-硝基氯苯、4-硝基氯苯標準溶液：質(zhì)量濃度均為1 000μg/mL，標準物質(zhì)編號分別為GSB07-1211-2000、GSB07-1215-2000、GSB07-1216-2000、GBW(E)082771，北京環(huán)境保護部標準樣品研究所。

甲醇中2，4-二硝基氯苯、五氯硝基苯標準溶液：質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL，標準物質(zhì)編號分別為BW 900724-1000-A、BW 900748-1000-A，北京壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

磷酸二氫鉀：優(yōu)級純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

氫氧化鈉：分析純，北京國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

甲醇、乙腈：色譜純，美國Dikma Pure 公司。

實驗用水為超純水，由Milli-Q Academic 型超純水機制得。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理條件

將水質(zhì)樣品以0.45 μm 濾膜過濾后移入樣品瓶上機處理，樣品經(jīng)過在線SPE 柱將包含目標組分的有機類物質(zhì)與其它無機類物質(zhì)分離。在線SPE柱選用Acclaim 極性嵌入式固定相RSLC 柱(33 mm×3 mm，3 μm，美國賽默飛世爾科技公司)，柱溫為30 ℃，富集液為超純水和乙腈；為了節(jié)省溶劑的同時保護SPE 柱與切換閥，采用梯度富集模式，流量與濃度梯度變化詳見表1，富集樣品體積為2 500 μL。

表1 在線SPE 富集流量與濃度梯度表

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Acclaim 120 C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國賽默飛世爾科技公司)；柱溫：30 ℃；進樣體積：2 500 μL；流動相：pH 6.5 的磷酸二氫鉀緩沖溶液[18]-乙腈，富集-萃取狀態(tài)切換閥時間為實驗開始后第6 min，萃取-清洗狀態(tài)切換閥時間為第26 min，萃取-分析流路的流動相變化比例采用二段梯度的模式，第一段為5 %/min，第二段為6.25 %/min，具體的流量與濃度梯度見表2；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：220 nm；波長寬度：4 nm；以色譜峰面積外標法定量。以質(zhì)量濃度均為200 μg/L 的標準物質(zhì)溶液上機測試，目標物的色譜保留時間區(qū)間為18.0～24.5 min，標準溶液色譜圖如圖1 所示。

表2 流動性體積分數(shù)梯度表

圖1 200 μg/L 標準物質(zhì)溶液的色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件選擇與優(yōu)化

2.1.1 進樣體積

設(shè)置富集體積分別為500、1 500、2 500 μL 的相同濃度標準物質(zhì)，經(jīng)過在線SPE 處理后檢測，色譜圖如圖2 所示。

圖2 相同濃度待測物不同富集量下的疊加色譜圖

由圖2 可見，在不超過在線SPE 系統(tǒng)處理能力上限的前提下，萃取體積與檢測器上待測物的響應(yīng)信號呈正相關(guān)關(guān)系，故直接選擇進樣器最大體積2 500 μL 進行分析。

2.1.2 在線SPE 柱與色譜柱的組合

(1)在線SPE 柱。分別選擇兩種尺寸規(guī)格的Acclaim 極性嵌入式固定相RSLC 柱作為SPE 柱使用，規(guī)格分別為33 mm×3 mm、50 mm×3 mm，其余參數(shù)相同。在進樣體積為2 500 μL 的情況下，50 mm×3 mm 色譜柱最大工作壓力達40 MPa 左右，而33 mm×3 mm 色譜柱為35 MPa 左右，且洗脫所需時間稍短，考慮到標準工作曲線最高點濃度為200 μg/L，進樣體積為2 500 μL 時仍未超出后者的富集能力上限，因此最終選擇33 mm×3 mm 色譜柱作為在線SPE 柱。

(2)反相色譜柱。分別選用Acclaim 120 C18柱、Venusil ASB C18柱、Acclaim 120 C8柱3 種反相色譜柱對6 種目標物進行測試并考察分離度。當(dāng)采用C8色譜柱時，2，4-二硝基氯苯與2-硝基氯苯、4-硝基氯苯與3-硝基氯苯分離度很差；兩種C18色譜柱的分離效果則較為接近，在待測物濃度較大時，Acclaim C18柱在2-硝基氯苯與4-硝基氯苯的分離上稍有優(yōu)勢，因此最終選擇Acclaim C18柱作為分離用色譜柱。

2.1.3 柱溫

SPE 柱與分析柱共用一個色譜柱箱，選擇柱箱溫度分別為20、30、40 ℃，考察液相色譜儀的工作情況。柱溫為20 ℃時，由于熱脹冷縮的緣故，SPE 柱的工作壓力峰值可達41 MPa 左右，影響SPE 柱的使用壽命；而柱溫為40 ℃時，SPE 柱與分析柱的壓力皆有下降，但目標物色譜保留時間也有提前，且變化程度不一，并導(dǎo)致2-硝基氯苯與4-硝基氯苯的分離度變差，綜合考慮，確定柱溫選擇為30 ℃。

2.1.4 流動相及淋洗梯度

硝基苯在強酸性條件下易被還原為苯胺，硝基氯苯類在pH 較高時水解反應(yīng)速率則會加快，故流動相pH 應(yīng)控制在中性范圍內(nèi)。由于2-硝基氯苯、3-硝基氯苯、4-硝基氯苯屬于同素異構(gòu)體，分離難度較大，故流動相起始濃度中水相的比例應(yīng)較大。以濃度梯度洗脫的方式逐漸緩慢增加有機相的比例直至3 種同素異構(gòu)體分離完畢，再以高有機相比例洗脫吸附性較強的五氯硝基苯。經(jīng)測試，在流動相水相中，磷酸鹽體系緩沖溶液優(yōu)于乙酸鹽體系緩沖溶液和純水；有機相中，乙腈體系分離效率高于甲醇，且吸收波長上限較低，對各待測物的分析干擾較小。流動相水相起始比例在90%或以上時，有機相比例增加速率不高于5%/min 時，6 種待測物質(zhì)即可有較好的分離效果，故流動相變化比例采用二段梯度的模式，第一段為5%/min，用于分離同素異構(gòu)體，第二段為6.25%/min，可適當(dāng)增加速率，以便節(jié)省時間。

2.1.5 檢測器

硝基苯在非衍生化的情況下沒有熒光效應(yīng)，故選擇紫外檢測器。經(jīng)測定，各目標物的最大紫外吸收波長：硝基苯為260 nm，2-硝基氯苯、3-硝基氯苯、4-硝基氯苯為220 nm，2，4-二硝基氯苯為250 nm，五氯硝基苯為190 nm。其中五氯硝基苯較為特殊，在吸收波長大于230 nm 之后響應(yīng)信號會急劇降低，而其它物質(zhì)的吸收波長寬度均有40～50 nm。若確定吸收波長為190 nm，則有利于五氯硝基苯的測定，但在流動相中乙腈梯度式變化的情況下，溶劑干擾會更加嚴重，綜合多方面的考慮，將檢測器波長設(shè)定為220 nm，此時相同濃度的各待測物質(zhì)響應(yīng)值在同一數(shù)量級且均較為明顯，而溶劑干擾亦十分微小，可忽略不計。

2.2 標準工作曲線及檢出限

移取6 種目標化合物的標準溶液各100 μL，混合后以甲醇定容至2 mL，制成質(zhì)量濃度為50 μg/mL 的標準儲備液，再分別取標準儲備液1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、40.0 μL 于10 mL 容量瓶中，以超純水定容至標線，制備成質(zhì)量濃度均分別為5.00、10.0、25.0、50.0、100、200 μg/L 系列標準工作溶液，以0.45 μm濾膜過濾后移入樣品瓶上機分析。以系列標準工作溶液的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標，對應(yīng)檢測器信號的峰面積(y)為縱坐標，進行線性擬合，得到標準工作曲線。

移取6 種目標化合物的標準溶液各1 μL，分別以甲醇定容至1 mL，稀釋成質(zhì)量濃度均為1 000 μg/L 的中間液，取硝基苯、2-硝基氯苯、4-硝基氯苯中間液各4 μL，2，4-二硝基氯苯中間液3.5 μL，3-硝基氯苯中間液5 μL，五氯硝基苯中間液3 μL，混合后以甲醇定容至10 mL，此時硝基苯、2-硝基氯苯、4-硝基氯苯的質(zhì)量濃度均為0.40 μg/L，2，4-二硝基氯苯的質(zhì)量濃度為0.35 μg/L，3-硝基氯苯的質(zhì)量濃度為0.50 μg/L，五氯硝基苯的質(zhì)量濃度為0.30 μg/L。重復(fù)配制上述溶液7 次，以0.45 μm 濾膜過濾后移入樣品瓶，上機分析，以環(huán)境監(jiān)測分析方法標準制訂技術(shù)導(dǎo)則(HJ 168—2020)附錄A 中的計算方法得到各目標化合物的檢出限[20]。

各目標化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表3。由表3 可知，各目標化合物的質(zhì)量濃度在5.00～200 μg/L 范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.06～0.10 μg/L，遠遠低于地表水環(huán)境質(zhì)量標準中規(guī)定的限值[19]，滿足常規(guī)監(jiān)測需求。

表3 線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.3 精密度試驗

按照1.2 實驗方法測定同一被硝基氯苯類物質(zhì)污染的工業(yè)廢水樣品6 次，試驗結(jié)果見表4。由表4 可知，6 種目標物測定結(jié)果的相對標準偏差為0.5%～2.3%，表明該方法精密度良好。

表4 精密度試驗結(jié)果

2.4 加標回收試驗

分別取20 mL 地表水、工業(yè)廢水，分別加入4、16 μL 質(zhì)量濃度為50 μg/mL 的標準儲備液，理論加標質(zhì)量濃度分別為10、40 μg/L，將加標后樣品混合均勻后，以0.45 μm 濾膜過濾后移入樣品瓶，各加標樣品分別檢測6 次，測定結(jié)果分別見表5、表6。由表5、表6 可知，各目標物的平均加標回收率為98.1%～102%，表明該方法測定準確度較高。

表5 地表水樣品加標回收試驗結(jié)果

表6 工業(yè)廢水樣品加標回收試驗結(jié)果

3 結(jié)語

建立了在線固相萃取-高效液相色譜法測定水中硝基苯與5 種硝基氯苯類化合物的方法，在優(yōu)化的實驗條件下，各待測物檢出限遠低于地表水環(huán)境質(zhì)量標準中的規(guī)定限值，同時也低于傳統(tǒng)高效液相色譜法的相應(yīng)物質(zhì)檢出限，滿足各目標物的痕量分析需求。該方法各目標物線性區(qū)間寬，精密度、準確度滿足分析要求，所需樣品量少，操作簡便，安全性高，適用于水中污染物的監(jiān)測。