潘忠全，黃選忠

(1.湖北遠(yuǎn)安縣疾病預(yù)防控制中心，湖北遠(yuǎn)安 444200； 2.湖北興山縣疾病預(yù)防控制中心，湖北興山 443700)

巴比妥酸是合成巴比妥、苯巴比妥等鎮(zhèn)靜催眠藥和維生素B12 等藥品的中間體[1]。由于巴比妥酸在生理條件下99%以上是離子狀態(tài)而無療效[2]，因此需要監(jiān)測巴比妥、苯巴比妥和維生素B12 等藥品中的巴比妥酸含量。

硝酸鹽對人體有害，過量攝入可能導(dǎo)致高鐵血紅蛋白血癥，并在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成致癌性的亞硝胺[3]，持續(xù)少量攝入也會引起消化不良、精神抑郁和頭痛[4]，中國藥典對相關(guān)藥品中硝酸鹽的含量均有明確的限量要求，如維生素B1 原料藥中硝酸鹽含量不得大于0.25%[5]，因此監(jiān)測藥品中硝酸鹽含量對保障用藥安全具有重要意義。

目前測定藥品中微量巴比妥酸的方法已報道的有化學(xué)發(fā)光法[6]和分光光度法[7]，其中，化學(xué)發(fā)光法需要專用儀器，而分光光度法則靈敏度偏低。離子色譜法已成為測定無機陰離子和有機酸的首選方法之一，應(yīng)用于維生素B1 注射液中的EDTA 及硝酸根離子的同時測定[4]和水、尿液、食品等樣品中鄰苯二甲酸(根)、草酸、枸櫞酸、琥珀酸、檸檬酸、酒石酸、乙醇酸、甲酸、乙酸、酒石酸、氨基磺酸等有機酸的定量分析[8-14]，但測定藥品中巴比妥酸尚未見報道。筆者用SH-AC-3 型陰離子交換柱和CIC-100 型色譜儀同時測定巴比妥、苯巴比妥和維生素B12 等藥品中的巴比妥酸和硝酸鹽，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性良好，操作簡便快速，可用于巴比妥、苯巴比妥和維生素B12 等樣品中微量巴比妥酸和硝酸鹽的定量分析。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

離子色譜儀：CIC-100 型，配SHY-2 型自再生抑制器，青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司。

自動進樣器：SHA-15 型，青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司。

0.45 μm 濾膜過濾器：Φ13 mm，青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司。

巴比妥酸：分析純，C4H4N2O3·2H2O，北京國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

巴比妥酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 mg/L，稱取1.294 2 g巴比妥酸，用高純水溶解定容于1 000 mL 容量瓶中。

磷酸二氫鉀、溴化鉀：分析純，北京國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

H2PO4-標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 mg/L，準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鉀0.140 2 g，于105 ℃烘烤2 h，用高純水溶解，定容于100 mL 容量瓶中。

Br-標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 mg/L，準(zhǔn)確稱取溴化鉀0.148 9 g，于105 ℃烘烤2 h，用高純水溶解，定容于100 mL 容量瓶中。

NO3-、F-、Cl-、SO42-標(biāo)準(zhǔn)溶液：質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號分別為GBW(E) 080223、GBW(E) 080549、GBW(E) 080268、GBW (E)080266，中國計量科學(xué)研究院。

NO2-標(biāo)準(zhǔn)溶液：質(zhì)量濃度為100 mg/L，編號為GBW(E)080223，中國計量科學(xué)研究院。

無水碳酸鈉、碳酸氫鈉：分析純，北京國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

藥物樣品：(1)巴比妥，化學(xué)純，含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))大于98%，批號為180610，成都化學(xué)試劑廠；(2)苯巴比妥片，規(guī)格為30 mg/片，批號為36200701，精華制藥集團股份有限公司；(3)維生素B12 片，規(guī)格為20 μg/片，批號為F200706，山西云鵬醫(yī)藥集團有限公司。

實驗所用其它試劑均為分析純。

實驗用水為高純水，電阻率為18.2 MΩ·cm。

1.2 儀器工作條件

色譜分離柱：SH-AC-3 型陰離子交換柱(250 mm×4.0 mm，10 μm，青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司)；保 護 柱：SH-AC-3 型(50 mm×4.0 mm，青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司)；淋洗液：5.0 mmol/L Na2CO3溶液，流量為1.0 mL/min；柱箱溫度：35 ℃；電流：75 mA；檢測器：電導(dǎo)檢測器；自動進樣器：全定量環(huán)取樣，取樣后清洗(每針之間)；置換量：70 μL；取樣體積：25 μL；進樣深度：4 mm。

1.3 實驗方法

1.3.1 系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

將巴比妥酸和NO3-標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成含巴比妥酸和NO3-均分別為10.0 mg/L(A 液)和100.0 mg/L(B 液)，臨用現(xiàn)配。再分別取A 液0.10、0.25、0.50、1.00 mL 及B 液0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于10只10 mL 容量瓶中，加純水至標(biāo)線，混勻，配制成含巴比妥酸和NO3-均分別為0.10、0.25、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00 和50.0 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取1.3.1 制備的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每種濃度各取1.5 mL 于樣品瓶中，啟動自動進樣器進樣，分別測定，以巴比妥酸和NO3-的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)、以巴比妥酸和硝酸鹽的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.3 樣品處理

稱取巴比妥0.250 g，用5 mL 無水乙醇溶解，再用高純水定容至100 mL，取該溶液用高純水稀釋至2 倍體積，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后作為樣品溶液A。該樣品溶液中巴比妥的質(zhì)量濃度為1.250 g/L。

將苯巴比妥片研磨均勻稱取0.420 g(含苯巴比妥200 mg)，加入10 mL 無水乙醇，充分?jǐn)嚢枞芙猓酶呒兯ㄈ葜?00 mL，濾去不溶物，濾液用高純水稀釋至2 倍體積，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后作為樣品溶液B。該樣品溶液中苯巴比妥的質(zhì)量濃度為1.000 g/L。

取維生素B12 片40 片(含維生素B12 約1000 μg)，用高純水洗去表面糖衣，用高純水充分研磨溶解，定容至100 mL，濾去不溶物，濾液用0.45 μm濾膜過濾，作為該樣品溶液C。該樣品溶液中維生素B12 的質(zhì)量濃度為10 mg/L。

1.3.4 樣品測定

取樣品溶液1.5 mL 于樣品瓶中，啟動自動進樣器進樣測定巴比妥酸和NO3-的色譜峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，同時進行加標(biāo)回收試驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 淋洗液

考察了流量為1.0 mL/min，淋洗液中Na2CO3與NaHCO3溶液濃度(單位mmol/L)比分別為5∶0、5∶0.5、5∶0.75、5∶1.0 時，SH-AC-3 型柱對 巴 比妥酸、硝酸鹽、H2PO4-與硫酸鹽常見陰離子的分離情況，結(jié)果見表1。

由表1 可知，隨著淋洗液中NaHCO3濃度的增加，硝酸鹽的色譜峰分離度呈降低趨勢，巴比妥酸的色譜峰分離度則無明顯改變，而H2PO4-的色譜峰分離度逐漸增加，為使巴比妥酸和硝酸鹽均有較高的色譜峰分離度，選擇Na2CO3溶液作為淋洗液。選擇不同濃度的Na2CO3溶液分別進行試驗，當(dāng)Na2CO3溶液濃度分別為4.0、5.0、6.0 mmol/L 時，巴比妥酸的色譜峰分離度分別為4.97、3.60、3.10，硝酸鹽的色譜峰分離度分別為2.04、1.96、1.77，完全滿足相鄰組分完全分離的要求(R ≥1.5)[15]，SO42-的保留時間分別為16.615、13.539、11.746 min，綜合考慮待測組分的色譜峰分離度及SO42-的保留時間，最終選擇5.0 mmol/L 的Na2CO3溶液為淋洗液，在此淋洗條件下巴比妥酸和硝酸鹽與常見陰離子的分離良好。

2.1.2 色譜柱

以5.0 mmol/L Na2CO3溶液為淋洗液，流量為1.0 mL/min，等度洗脫，考察SH-AC-1 型和SHAC-3 型陰離子交換柱分別對巴比妥酸和硝酸鹽與其它常見陰離子的分離效果。結(jié)果表明，SH-AC-1型陰離子交換柱雖然能將氯化物、硝酸鹽和硫酸鹽完全分離，但不能將氯化物與巴比妥酸完全分離且巴比妥酸嚴(yán)重拖尾、色譜峰形較差，SH-AC-3 型陰離子交換柱不僅能將氯化物與巴比妥酸完全分離且巴比妥酸的峰形良好，最終選擇SH-AC-3 型陰離子交換柱為分離柱。

2.1.3 淋洗液流量

考察淋洗液流量分別為0.8、1.0、1.2 mL/min 時各組分的分離情況，試驗結(jié)果見表2。

表2 不同淋洗液流量時各組分保留時間( t )及分離度(R)

由表2 可知，隨著淋洗液流量的增大，各組分的保留時間(t)逐漸縮短，峰分離度(R)和色譜峰面積逐漸減小。當(dāng)淋洗液流量從0.8 mL/min增大至1.0 mL/min 時，硝酸鹽的保留時間縮短2.0 min，分離度變化較??；當(dāng)淋洗液流量從1.0 mL/min 增大至1.2 mL/min 時，保留時間縮短1.3 min，峰分離度從1.98下降至1.77；當(dāng)淋洗液流量從0.8 mL/min 增大至1.0 mL/min 時，巴比妥酸的保留時間縮短2.3 min，分離度從4.04 下降至3.90；當(dāng)淋洗液流量從1.0 mL/min 增大至1.2 mL/min 時，保留時間縮短1.6 min，分離度從3.90 下降至3.75。另外，淋洗液流量每增加0.20 mL/min 巴比妥酸和硝酸鹽的色譜峰面積約下降18%～20%。在保證目標(biāo)分析物與其它離子良好分離的前提下，以使組分有較短的保留時間、較高的色譜峰分離度和檢測靈敏度、系統(tǒng)有較低的壓力，綜合考慮，確定淋洗液流量為1.0 mL/min。

2.1.4 柱箱溫度

考察柱箱溫度分別為30、35、40 ℃時各組分的分離效果，結(jié)果顯示，隨著柱溫的升高，巴比妥酸和硝酸鹽的保留時間稍微縮短，色譜峰面積逐漸增加。當(dāng)柱溫從30 ℃上升到35 ℃時，硝酸鹽色譜峰面積增加6.7%；從35 ℃上升到40 ℃時，硝酸鹽色譜峰面積增加5.6%。當(dāng)柱溫從30 ℃上升到35 ℃時，巴比妥酸色譜峰面積增加4.4%；而從35 ℃上升到40℃時，巴比妥酸色譜峰面積僅增加1.6%。這與鄰苯二甲酸根的試驗結(jié)果[8]類似，同時硝酸鹽的色譜峰分離度逐漸降低，分別為1.94、1.78 和1.65，巴比妥酸的色譜峰分離度則逐漸增加，分別為3.62、3.80 和4.54。綜合考慮待測組分的檢測靈敏度和色譜峰分離度，選擇柱箱溫度為35 ℃。

2.2 共存物質(zhì)的影響

取各種標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成含巴比妥酸20 mg/L，硝酸鹽、磷酸鹽各10 mg/L，氯化物、溴化物、硫酸鹽、亞硝酸鹽各5 mg/L，氟化物3 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，取1.5 mL 于樣品瓶中，啟動自動進樣器進樣測定，以考察巴比妥酸和硝酸鹽與前述6 種常見陰離子的分離效果，巴比妥酸鹽、硝酸鹽與常見陰離子色譜圖見圖1。由圖1 可知，在優(yōu)化的實驗條件下，巴比妥酸和硝酸鹽與前述6 種常見陰離子可以完全分離，其中磷酸鹽與硫酸鹽不能完全分離，除磷酸鹽與硫酸鹽外，其余組分的出峰順序均在待測物之前，均不影響巴比妥酸和硝酸鹽的測定。

圖1 巴比妥酸鹽、硝酸鹽與常見陰離子色譜圖

2.3 線性方程、線性范圍與檢出限

按照1.3.1 配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，依次測定并計算標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、相關(guān)系數(shù)。測定儀器30 min 的基線噪聲[16]，以3 倍基線噪聲除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計算巴比妥酸和硝酸鹽的檢出限。巴比妥酸和硝酸鹽的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表3。由表3 可知，巴比妥酸的色譜峰面積與其質(zhì)量濃度在0.10～50.0 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9；硝酸鹽的色譜峰面積與其質(zhì)量濃度分別在0.10～30.0 mg/L 和30.0～50.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 4 和0.999 9。巴比妥酸和硝酸鹽的檢出限分別為0.10 mg/L 和0.03 mg/L。10 mg/L 的巴比妥酸和硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的色譜圖見圖2。

表3 巴比妥酸和硝酸鹽的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

圖2 巴比妥酸鹽和硝酸鹽混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.4 樣品測定及加標(biāo)回收試驗

按1.3 方法操作，測定巴比妥、維生素B12 和苯巴比妥等樣品中的巴比妥酸和硝酸鹽的含量。并在3 種樣品中分別添加1.0、5.0、10.0 mg/L 的巴比妥酸和硝酸鹽，平行測定5 次，計算加標(biāo)回收率及測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4。由表4 可知，巴比妥、苯巴比妥和維生素B12 等3 種樣品中硝酸鹽的加標(biāo)回收率為98.0%～101.3%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.21%～2.66%；巴比妥酸的加標(biāo)回收率為90.4%～101.4%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.71%～2.39%，表明該方法回收率較高、重現(xiàn)性良好。加標(biāo)苯巴比妥樣品色譜圖見圖3。

圖3 苯巴比妥加標(biāo)樣品色譜圖

表4 巴比妥、苯巴比妥和維生素B12 樣品測定及加標(biāo)回收試驗結(jié)果

3 結(jié)語

建立了以SH-AC-3 型陰離子交換柱為分離柱，以5.0 mmol/L Na2CO3溶液為淋洗液，流量為1.0 mL/min 等度洗脫，離子色譜-抑制電導(dǎo)檢測法同時測定藥品中巴比妥酸和硝酸鹽的分析方法。該方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性良好，操作簡便快速，可用于巴比妥、苯巴比妥和維生素B12 等樣品中微量巴比妥酸和硝酸鹽的定量分析。