于浩洋，馮靜，李顏巖

(遼寧省疾病預(yù)防控制中心，沈陽(yáng) 110005)

2020 年，黑龍江省雞西市雞東縣某家庭聚餐導(dǎo)致多人中毒事件引發(fā)關(guān)注[1]。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在該家庭聚餐食品玉米面中檢出了高濃度的米酵菌酸，同時(shí)在患者胃液中亦有檢出。1953 年以來(lái)，我國(guó)學(xué)者陸續(xù)在16 個(gè)省份發(fā)現(xiàn)了由當(dāng)?shù)靥厣称芬鸬囊賳伟澄镏卸?45 起，中毒人數(shù)3 352 人，死亡1 401 人，平均病死率高達(dá)41.80%，是我國(guó)病死率較高的一種微生物性食物中毒[2]。

米酵菌酸是椰毒假單胞菌酵米面亞種產(chǎn)生的一種可以引起食物中毒的毒素，具有強(qiáng)烈的毒性[3]。谷類制品(米粉、發(fā)酵玉米面等)、變質(zhì)銀耳和薯類制品(馬鈴薯粉條、甘薯淀粉、山芋淀粉等)為主要受污染食品[4]。米酵菌酸無(wú)臭無(wú)味，被污染的食品沒(méi)有明顯變化[5]，一旦上述食品因儲(chǔ)存不當(dāng)而產(chǎn)生米酵菌酸毒素，即使加熱烹制也無(wú)法消除。該菌產(chǎn)生的毒素米酵菌酸對(duì)人體的肝、腎、心、腦等重要器官均能產(chǎn)生嚴(yán)重的損害，是引起人們嚴(yán)重食物中毒和死亡的主要原因[6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7]，米酵菌酸中毒潛伏期僅為0.5～2 h，病情發(fā)展迅速，很快出現(xiàn)肝、腎等多臟器實(shí)質(zhì)性損傷[5]。建立米酵菌酸的快速檢測(cè)方法，對(duì)及時(shí)鑒定中毒病因、中毒患者的毒物溯源、評(píng)估中毒水平以及中毒患者的救治工作具有重要意義。

目前，針對(duì)米酵菌酸常用的檢測(cè)方法包括液相色譜法[8-10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-14]?，F(xiàn)行的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.189—2016[15]采用高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵米面及其制品、銀耳及其制品、等食品中的米酵菌酸。液相色譜法具有靈敏度較低且過(guò)程繁瑣耗時(shí)、樣品處理試劑消耗量大等缺點(diǎn)。覃冬杰等[16]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定柳州螺螄粉中米酵菌酸，雖大大提高了方法的靈敏度、減少了試劑的使用量，但其前處理采用MAX固相萃取柱凈化，耗時(shí)較長(zhǎng)。

筆者采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLCMS/MS)法建立一種快速測(cè)定米粉中米酵菌酸的分析方法，該方法分析速度快，樣品處理簡(jiǎn)單高效，定性、定量準(zhǔn)確，檢出限低，靈敏度高，重現(xiàn)性好，是快速、準(zhǔn)確測(cè)定米粉中米酵菌酸的可靠方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：3200QTRAP型，美國(guó)AB 公司。

渦旋振蕩器：Lab Dancer 型，德國(guó)艾卡公司。

高速冷凍離心機(jī)：Thermo ST16R 型，美國(guó)賽默飛世爾公司。

電子天平：BS 110S 型，感量為0.1 mg，德國(guó)賽多利斯公司。

超純水系統(tǒng)：MILLI-Q Gradient 型，法國(guó)默克密理博公司。

超聲波清洗器：KQ5200DB 型，昆山市超聲儀器有限公司。

針式濾器：Pall Corpration Acrodisc 型，孔徑為0.2 μm，直徑為13 mm，美國(guó)頗爾公司。

水中米酵菌酸溶液：10 μg/mL，生產(chǎn)批號(hào)為S057505，天津阿爾塔科技有限公司。乙腈、甲醇：色譜純，美國(guó)費(fèi)希爾公司。氨水：分析純，西隴科學(xué)股份有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國(guó)沃特世公司)；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：4 ℃；流動(dòng)相：A 相為水，B 相為乙腈，流量為0.4 mL/min，梯度洗脫；梯度洗脫程序：0～1.0 min 80% A，1.0～2.0 min 80%～5% A，2.0～4.0 min 5% A，4.0～4.1 min 5%～80% A，4.1～6.0 min 80% A。

1.2.2 串聯(lián)質(zhì)譜

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：負(fù)離子掃描；離子噴霧電壓：- 4 500 V；離子源溫度：550 ℃；噴霧氣壓力：413.7 kPa；輔助加熱器壓力：413.7 kPa；氣簾氣壓力：137.9 kPa；其它質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間見(jiàn)表1。

表1 米酵菌酸的質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取1 g 米粉(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中，加入15 mL 甲醇-氨水溶液（每80 mL甲醇加入1 mL 氨水，加水定容至100 mL），渦旋提取2 min，于室溫下置于暗處浸泡1 h，超聲提取30 min，以10 000 r/min 離心5 min，過(guò)0.22 μm 濾膜后上機(jī)分析。

1.3.2 溶液配制

米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：60 μg/mL，準(zhǔn)確吸取水中米酵菌酸溶液適量，用甲醇配制而得。

米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：3.0 μg/mL，準(zhǔn)確吸取米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液500 μL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，于-20 ℃下保存。

系列米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取適量米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于空白樣品中，按照1.3.1 方式進(jìn)行處理，配制成米酵菌酸質(zhì)量濃度分別為2、10、50、100、150、200 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

米酵菌酸是含有3 個(gè)羧基的脂肪酸，容易失去質(zhì)子帶上負(fù)電荷[17]，故選擇ESI 負(fù)離子模式檢測(cè)。在負(fù)離子模式下，優(yōu)化質(zhì)譜條件，發(fā)現(xiàn)Q1 掃描時(shí)米酵菌酸失去1 個(gè)質(zhì)子形成了豐度較高的[M-H]-峰，其質(zhì)荷比為485.3；選擇[M-H]-峰作為其母離子進(jìn)行MS2 掃描，找到了豐度較大穩(wěn)定性較好的兩個(gè)子離子，分別為m/z441.4、m/z397.4，此二碎片離子分別為母離子失去一分子CO2和兩分子CO2所形成。再采用MRM 模式優(yōu)化碰撞能、錐孔電壓等參數(shù)，使分子離子對(duì)的響應(yīng)值達(dá)到最強(qiáng)，其中，m/z441.4 離子響應(yīng)較強(qiáng)，作為定量離子；m/z397.4 離子作為定性離子。

2.2 色譜條件優(yōu)化

在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，分別比較了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%氨水三種流動(dòng)相對(duì)米酵菌酸色譜峰峰形及響應(yīng)值的影響。由于米酵菌酸采用負(fù)離子掃描模式進(jìn)行檢測(cè)，理論上堿性流動(dòng)相會(huì)促進(jìn)米酵菌酸電離，增強(qiáng)米酵菌酸的響應(yīng)。然而試驗(yàn)結(jié)果表明，在堿性環(huán)境下，米酵菌酸的響應(yīng)值偏低、色譜峰形不佳且拖尾明顯。

有文獻(xiàn)報(bào)道提出，在酸性環(huán)境下，米酵菌酸具有較好的峰形和較高的響應(yīng)值[18-19]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相時(shí)，米酵菌酸響應(yīng)值比堿性環(huán)境雖有提高，但色譜峰有明顯分叉；以乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，米酵菌酸色譜峰半峰寬、峰形及響應(yīng)值與酸性及堿性環(huán)境相比有明顯改善，因此選用乙腈-水作為流動(dòng)相。

以乙腈-水為流動(dòng)相，采用ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱對(duì)米酵菌酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，與等度洗脫相比，梯度洗脫分析時(shí)間更短、色譜峰半峰寬更窄，并且能克服等度洗脫時(shí)待測(cè)物與干擾雜質(zhì)一起流出、對(duì)待測(cè)物的離子化產(chǎn)生抑制作用以及色譜峰背景干擾的缺點(diǎn)。優(yōu)化后的梯度洗脫程序見(jiàn)1.2.1。

2.3 樣品處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.3.1 萃取

米酵菌酸是一種脂溶性的酸性化合物，易溶于乙醚、甲醇、氯仿、乙腈等有機(jī)溶劑和堿性水溶液[20]。文獻(xiàn)[16]表明以甲醇和乙腈作為提取溶劑時(shí)米酵菌酸回收率無(wú)明顯差別，使用氯仿作萃取劑則回收率較低，從毒性及經(jīng)濟(jì)性考慮，采用甲醇作為提取溶劑。實(shí)驗(yàn)比較了甲醇、80%甲醇-水和50%甲醇-水對(duì)米酵菌酸提取效率的影響，結(jié)果表明，80%甲醇-水對(duì)米酵菌酸提取率最高。由于米酵菌酸分子結(jié)構(gòu)中含有3 個(gè)羧基，在堿性環(huán)境下能夠解離出氫離子而帶一部分負(fù)電荷，更易溶于有機(jī)溶劑中，因此考慮在80%甲醇-水溶液中加入一定量的氨水，最終確定選擇體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇水溶液(含1%氨水)作為提取液。

2.3.2 超聲時(shí)間

超聲提取具有提取效率高、提取時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[21]，成為近年來(lái)應(yīng)用較為廣泛的食品提取方式之一，試驗(yàn)考察了超聲提取時(shí)間分別為10、20、30、40 min 時(shí)米酵菌酸的提取效率，發(fā)現(xiàn)超聲時(shí)間為30 min 時(shí)回收率最高，延長(zhǎng)超聲時(shí)間對(duì)增加回收率無(wú)明顯影響，因此選擇超聲時(shí)間為30 min。

2.4 方法的線性關(guān)系、檢出限與定量限

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)試系列米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以溶液的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，定量離子對(duì)色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性方程、相關(guān)系數(shù)。

以3 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限，以10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法的定量限。

本法測(cè)定米酵菌酸的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限列于表2。由表2 可知，米酵菌酸的質(zhì)量濃度在2～200 μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.998。檢出限為0.67 μg/L，定量限為2.0 μg/L。

表2 米酵菌酸的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取18 份空白米粉1 g 作為本底，分別加入高、中、低三個(gè)質(zhì)量濃度水平的米酵菌酸，每個(gè)濃度水平進(jìn)行6 次平行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，米酵菌酸的平均加標(biāo)回收率為96.1%～98.4%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～2.5%，說(shuō)明該方法具有較好的精密度和較高的準(zhǔn)確度。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

建立了一種HPLC-MS/MS 方法快速檢測(cè)米粉中米酵菌酸濃度。該方法對(duì)儀器條件和樣品前處理過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，具有檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、檢出限低、靈敏度高等特點(diǎn)，適用于米粉中米酵菌酸的檢測(cè)。