仇騫慧，仇伊爾，陸國文，鄔穎杰

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，損害婦女的身體健康和心理健康，且近年來其發(fā)病呈年輕化趨勢[1]。盡管腫瘤的診治技術(shù)水平發(fā)展迅速，但乳腺癌，特別是三陰性乳腺癌的治療仍是一個難題。目前備受醫(yī)患關(guān)注的靶向治療具有選擇性高、對正常組織無損害等優(yōu)點，已成為眾多腫瘤治療方式中的首選，但靶向治療的發(fā)展需要進一步探究腫瘤分子機制。

Polo樣激酶家族（PLKs）包括PLK1、PLK2、PLK3、PLK4及PLK5，它們在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的DNA復(fù)制和有絲分裂中都起著重要的作用[2-3]。PLK1是該家族中被研究最深入的成員，在許多癌癥中出現(xiàn)異常表達(dá)，包括乳腺癌、鼻咽癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、生殖系統(tǒng)腫瘤和消化道腫瘤等[4]。研究表明，PLK1過表達(dá)可能加速了TP53（一種腫瘤抑制因子）的破壞而導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。在人類癌癥患者中，50%以上TP53被破壞[3]。PLK2（也稱為SNK）可能是一種腫瘤抑制因子，據(jù)報道，PLK2在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的表達(dá)顯著降低[5]。PLK3在GO和細(xì)胞周期晚期表達(dá)[6]，有PLK3缺陷的小鼠被發(fā)現(xiàn)多個器官自發(fā)地形成了腫瘤[7]。PLK4是著絲粒調(diào)控蛋白，可增加非整倍體的風(fēng)險，抑制PLK4的表達(dá)可提高癌癥治療敏感性[8]。目前對于PLK5的研究很少，有研究指出，PLK5在人腦腫瘤中表達(dá)下調(diào)[9]。本研究通過數(shù)據(jù)挖掘分析不同Polo樣激酶家族（PLKs）在人乳腺癌mRNA中的表達(dá)水平及與預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

1.1 數(shù)據(jù)庫檢索

1.1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫 使用該數(shù)據(jù)庫在對應(yīng)欄中輸入基因名稱、腫瘤類型、mRNA水平和樣本類型值0.01（可更改），表達(dá)差異（fold change，可自定），基因排名（Ranking 10%，可自定）等，研究PLKs在不同腫瘤中的差異表達(dá)，制成差異全景圖。

1.1.2 GEPIA2數(shù)據(jù)庫 在數(shù)據(jù)庫的對應(yīng)框中輸入研究基因名稱，選擇要分析的腫瘤（如BRCA）。本研究利用該數(shù)據(jù)庫分析了乳腺癌組織和正常乳腺組織中PLKs的表達(dá)情況。

1.1.3 UALCAN數(shù)據(jù)庫 在UALCAN數(shù)據(jù)庫輸入研究的基因，再在TCGA數(shù)據(jù)庫樣本中選擇研究腫瘤來分析有關(guān)預(yù)后的各種因素。本研究利用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析了不同PLKs的表達(dá)水平與癌癥分期、分類和個體年齡之間的關(guān)系。

1.1.4 Kaplan-Meier plotter繪圖儀 通過繪圖儀分析了乳腺癌患者的無復(fù)發(fā)生存期（RFS）、總生存期（OS）、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期（DMFS）和治療后進展率（PPS）。

1.1.5 cBioPortal數(shù)據(jù)庫 采用cBioPortal（www.cbioportal.org） 數(shù) 據(jù) 庫（選 擇TCGA庫，包括了1907例病理診斷為乳腺癌的患者）基因欄分別輸入PLKs來探索其基因變化，包括突變、擴增、深度缺失和多重mRNA的變化。

1.1.6 LinkedOmics數(shù)據(jù)庫 采用Linked Omic（shttps://www.linkedomics.orglogin.php）數(shù)據(jù)庫分析基因（如PLK1、PLK2）表達(dá)水平之間的關(guān)系。

1.1.7 功能富集和生物信息學(xué)分析 在該數(shù)據(jù)庫輸入研究基因，物種選擇智人。出現(xiàn)的富集分析結(jié)果包括細(xì)胞亞定位（CC）、生物過程（BP）和分子功能（MF），pathway內(nèi)可見相關(guān)信號通路。

1.2 結(jié)果

1.2.1 PLKs在各腫瘤中的差異表達(dá)使用Oncomine數(shù)據(jù)庫得到了一張差異全景圖，比較乳腺癌樣本和對照樣本中PLKs mRNA的差異表達(dá)。其中有11個數(shù)據(jù)集顯示，乳腺癌患者中PLK1mRNA的表達(dá)水平上調(diào)，6組數(shù)據(jù)顯示PLK4高表達(dá)。見封二彩圖3。

1.2.2 PLKs表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 乳腺癌樣本中PLK1、PLK4的水平高于正常樣本，見封二彩圖4。應(yīng)用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析了PLKs的mRNA表達(dá)水平與乳腺癌腫瘤分期關(guān)系、與乳腺癌患者生理年齡段的關(guān)系、與乳腺癌種類分型關(guān)系、與乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移分期的關(guān)系以及其與TP53突變的關(guān)系，見封二彩圖5～6、封三彩圖1～3。在UALCAN數(shù)據(jù)庫中，目前還沒有PLK5與乳腺癌臨床病理參數(shù)關(guān)系的研究數(shù)據(jù)。PLK1、PLK4在乳腺癌整個腫瘤分期、乳腺癌患者全年齡、所有臨床類型乳腺癌、乳腺癌各級淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TP53突變中均高表達(dá)，而PLK2、PLK3呈低表達(dá)或無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.3 PLKs表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系PLK1、PLK4高表達(dá)降低了RFS、OS及DMFS。同時PLK1、PLK3和PLK4的高表達(dá)降低了PPS。而PLK3和PLK5高表達(dá)增加了RFS，PLK2和PLK5高表達(dá)增加了DMFS。見表1。

表1 PLKs表達(dá)與乳腺癌患者RFS、DMFS、OS和PPS的關(guān)系

1.2.4 乳腺癌患者中的PLKs基因突變情況28例（1.52%）乳腺癌樣本中的PLKs發(fā)生了改變。突變、擴增、深度缺失和多重mRNA變化的頻率分別為1%、0.21%、0.26%和0.05%。根據(jù)乳腺癌病理分型和細(xì)分結(jié)果展示，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌1473例，PLKs突變22例（1.49%），其中突變、擴增、深度缺失和多次mRNA變化的發(fā)生率分別為0.95%、0.27%、0.2%和0.07%。229例乳腺浸潤性小葉癌中，5例（1.67%）PLKs異常突變，出現(xiàn)了突變和深度缺失，發(fā)生率分別為1.34%和0.33%。在89例乳腺導(dǎo)管和小葉混合癌中，只有1例（1.12%）發(fā)生PLKs突變。見圖1。

圖1 乳腺癌PLKs基因突變情況

1.2.5 乳腺癌中PLKs之間的關(guān)系PLK1與PLK2（=－0.2999，＜0.05）、PLK3（=－0.1596＜0.05）和PLK5（=－0.1798＜0.05）呈負(fù)相關(guān)，而PLK1與PLK4（=0.7264＜0.05）呈正相關(guān)。PLK2與PLK3（=0.0950＜0.05）呈正相關(guān)，與PLK4（=－0.1933，＜0.05）呈負(fù)相關(guān)。PLK3與PLK4呈負(fù)相關(guān)（=－0.2683，＜0.05），PLK3與PLK5呈正相關(guān)（=0.1599，＜0.05）。PLK4與PLK5呈負(fù)相關(guān)（=－0.2086＜0.05）。PLK2與PLK5之間無顯著相關(guān)性。

1.2.6 乳腺癌中PLKs富集情況的分析為了進一步研究PLKs在乳腺癌中的作用，我們基于David數(shù)據(jù)庫對PLKs進行了功能富集分析。如圖2所示，有19個GO項目被富集。PLKs富集在以下生物過程（BP）：蛋白質(zhì)磷酸化，有絲分裂細(xì)胞周期G2/M過渡過程負(fù)調(diào)控，G2DNA凋亡損傷檢查點，有絲分裂細(xì)胞周期檢查點，DNA損傷反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)p53介質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，蛋白酶體依賴泛素蛋白分解代謝過程調(diào)節(jié)，有絲分裂細(xì)胞周期G1/S過渡，肽基礎(chǔ)絲氨酸、磷酸化，有絲分裂及凋亡過程的負(fù)調(diào)控。細(xì)胞亞定位（CC）：PLKs與中心體、核仁、染色質(zhì)、突觸、中心粒和細(xì)胞質(zhì)相關(guān)。分子功能（MF）：PLKs與蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、ATP結(jié)合和蛋白激酶活性相關(guān)。只有一個KEGG通路在PLKs中富集，即FoxO家族信號通路。

圖2 PLKs的GO富集分析（David）

2 討論

PLK1可能在腫瘤的侵襲生長和淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，PLK1的陽性表達(dá)率在乳腺癌組織中明顯高于癌旁組織，表明PLK1過表達(dá)可能導(dǎo)致非整倍體的出現(xiàn)，使染色體不穩(wěn)定。此外，PLK1與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期相關(guān)，提示PLK1與乳腺癌組織的侵襲生長、轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能是乳腺癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)[10]。Maire等[11]發(fā)現(xiàn)，與LA、LB和HER-2的乳腺癌類型相比，PLK1在三陰性乳腺癌（TNBC）中的表達(dá)水平更高。據(jù)報道，PLK1在多種人類癌癥中高表達(dá)，抑制PLK1可降低癌細(xì)胞的存活率，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞化學(xué)藥物的敏感性，且對正常細(xì)胞影響不大[4]。由于TNBC沒有特異性的治療靶點，而PLK1在TNBC中高表達(dá)，因此使用PLK1抑制劑治療TNBC可能是一種可行的方法。TNBC比其他亞型乳腺癌更具侵襲性，長期復(fù)發(fā)率更高，預(yù)后更差，同時缺乏ER、PR和HER-2的表達(dá)。因此，針對其他亞型乳腺癌的有效靶向藥物對TNBC的治療效果較差。目前，TNBC的治療仍以傳統(tǒng)化療為主，但TNBC患者要承受化療的巨大毒副作用，可體內(nèi)的腫瘤卻對化療藥物不敏感，因此，PLK1及其抑制劑在TNBC治療中的研究仍值得進一步探索。

PLK2具有許多細(xì)胞外周期效應(yīng)，如促進細(xì)胞分化、抑制腫瘤形成及參與突觸激活后的重構(gòu)等。PLK2在腫瘤細(xì)胞的增殖和存活中有著重要作用，可能是癌癥治療的潛在靶點[12]。本研究結(jié)果顯示PLK2的表達(dá)與PLK1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。PLK2高表達(dá)可提高乳腺癌患者的DMFS，猜測PLK2可能在乳腺癌的發(fā)生和病情發(fā)展過程中起著負(fù)調(diào)控作用。

PLK3可以抑制ER陽性乳腺癌的細(xì)胞增殖。Naik等[13]研究發(fā)現(xiàn)，抑制乳腺癌細(xì)胞中的PLK3活性可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的異常增殖。因此，推測PLK3和雌激素敏感性指狀蛋白（Efp）可能參與了ER陽性的乳腺癌患者內(nèi)分泌治療出現(xiàn)耐藥的過程。在ER陽性乳腺癌中，雌激素可促進Efp的高表達(dá)，從而加速PLK3的降解，這對于雌激素依賴的ER陽性乳腺癌細(xì)胞的增殖是更有利的。故PLK3表達(dá)的變化可能影響著內(nèi)分泌耐藥的形成。

PLK4，也被稱為SAK或STK18，在異種移植瘤動物模型中，藥物抑制PLK4的表達(dá)或降低其活性可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長[14]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者中PLK4高表達(dá)降低了OS、DMFS、PPS和RFS。在相關(guān)性研究中，PLK4與PLK1兩者表達(dá)呈正相關(guān)，進一步說明PLK4具有致癌作用。

PLK5與PLK2、PLK3有很大的同源性[9]。PLK5蛋白主要位于細(xì)胞核，PLK5表達(dá)可抑制G1期進入S期，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和DNA損傷反應(yīng)，在細(xì)胞中的作用主要表現(xiàn)為增殖細(xì)胞的下調(diào)和靜止細(xì)胞的積累[9，15]。本研究，PLK5的高表達(dá)提高了患者的RFS和DMFS。

本研究系統(tǒng)分析PLKs在乳腺癌患者中的mRNA表達(dá)水平、突變程度及預(yù)后價值后，結(jié)果顯示PLK1和PLK4過表達(dá)與乳腺癌患者生存預(yù)后不良相關(guān)，且PLK1在乳腺癌中的表達(dá)與PLK4的表達(dá)呈正相關(guān)。乳腺癌中PLK2與PLK3表達(dá)正相關(guān)，乳腺癌中PLK3與PLK5表達(dá)正相關(guān)，PLK2與PLK5不相關(guān)。PLK2、PLK3和PLK5過表達(dá)提示預(yù)后良好。