王 芳，陳 敏，楊冬燕，毛 偉

重慶市血液中心，重慶 400000

ABO血型正確定型和RhD正確定型是《血站技術(shù)操作規(guī)程》中規(guī)定采供血機(jī)構(gòu)強(qiáng)制性檢測的項(xiàng)目，準(zhǔn)確、快速的血型檢測也是為臨床提供血液的安全性要求之一，是保障安全輸血的重要前提[1]。全自動(dòng)血型檢測系統(tǒng)具有快速、準(zhǔn)確，易于標(biāo)準(zhǔn)化、信息化和自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，滿足采供血機(jī)構(gòu)大規(guī)模標(biāo)本的血型篩查[2-3]。由于全自動(dòng)血型檢測系統(tǒng)受方法學(xué)的限制，時(shí)有ABO血型亞型漏檢的情況。本文就篩查實(shí)驗(yàn)室用PK7300全自動(dòng)血型檢測儀漏檢的血型進(jìn)行原因分析和鑒定，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 獻(xiàn)血者，男，18歲，漢族，血型復(fù)查時(shí)發(fā)現(xiàn)ABO血型正反定型不一致，將標(biāo)本送至中心輸血研究所進(jìn)行血型的確認(rèn)。

1.2試劑和儀器 單克隆抗A、抗B血型定型試劑(試劑1)、單克隆抗H定型試劑(上海血液生物)；單克隆抗A、抗B血型定型試劑(試劑2，長春博德)；人源抗A、抗B試劑(試劑3)、抗AB試劑(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所)；人ABO血型反定型用紅細(xì)胞試劑、A2細(xì)胞試劑(上海血液生物)，試劑均在有效期內(nèi)。Gene Quant Pro型DNA 濃度測定儀(英國)、ABI PE9700型擴(kuò)增儀(美國)、 Power Pac 3000型電泳儀(美國)、KST-5500型凝膠成像分析系統(tǒng)(北京東迅)、血型血清學(xué)離心機(jī) KA-2200 SeromamticⅡ(日本KUBOTA)、全自動(dòng)血型分析儀PK7300(貝克曼)(以下簡稱PK7300)。

1.3方法

1.3.1血清學(xué)檢測 ABO正反定型(紙板法、試管法)和吸收放散試驗(yàn)按照相關(guān)試劑說明書及《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第4版)》進(jìn)行操作。

1.3.2基因檢測 (1)DNA提取。以Puregene Blood Core Kit B DNA提取試劑(德國Qiagen)抽提全血標(biāo)本中基因組DNA。濃度大于20 ng/mL，A260/A280比值在1.6～1.9的標(biāo)本可用于檢測，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。(2)ABO血型基因SSP檢測。按照人類紅細(xì)胞ABO血型Cis-AB，B(A)基因分型試劑盒和A亞型基因分型試劑盒(PCR-SSP，天津秀鵬)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。

2 結(jié) 果

2.13種不同廠家標(biāo)準(zhǔn)血清試劑采用試管法檢測獻(xiàn)血者血型結(jié)果分析 通過血型血清學(xué)反應(yīng)格局分析，獻(xiàn)血者的血型疑為A亞B型或B(A)，需用分子生物學(xué)方法進(jìn)行確定。見表1。

表1 3種不同廠家試劑檢測ABO血型檢測結(jié)果

2.2紙板法和PK7300檢測結(jié)果分析 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的檢測試劑(試劑2)進(jìn)行血型的檢測，檢測結(jié)果顯示ABO血型為B型。

2.3ABO基因型檢測結(jié)果 人類紅細(xì)胞ABO血型-A亞型基因分型結(jié)果為B/O2，說明該獻(xiàn)血者沒有A基因，可以排除A亞B的可能。瓊脂糖凝膠電泳見圖1。人類紅細(xì)胞ABO血型-cis-AB，B(A)基因分型結(jié)果為B(A)04/O2，結(jié)合血清學(xué)檢測結(jié)果和A亞型分型試劑盒結(jié)果判斷該獻(xiàn)血者的血型結(jié)果為B(A)型，瓊脂糖凝膠電泳膠圖見圖2。

注：1～9為引物A201～A211；10～15為引物A301～A307；16～26為引物AW01～AW14；27～28為引物AM01～AM02；29～37為引物AX01～AX16；38～41為引物AeL02、04-06；42為引物A/O；43為引物B；44為引物O1；45為引物O2；46為陰性對(duì)照。圖1 ABO血型-A亞型基因分型電泳圖譜

注：1為引物cisAB01；2為引物cisAB01，B(A)01；3為引物B(A)01，B(A)03；4為引物cisAB02；5為引物B(A)02；6為引物cisAB03；7為引物B(A)04；8為引物B(A)06；9為引物cisAB04；10為引物B1；11為引物B2；12為引物O1；13為引物O2；14為陰性對(duì)照。圖2 ABO血型-cis-AB，B(A)基因分型電泳圖譜

3 討 論

PK7300檢測血型的原理是利用紅細(xì)胞的自然沉降通過機(jī)器視覺檢測系統(tǒng)(CCD系統(tǒng))進(jìn)行圖像數(shù)字化處理，利用獨(dú)特參數(shù)判斷是否發(fā)生凝集來進(jìn)行血型的檢測。由于血型檢測數(shù)據(jù)保存在圖像處理器的內(nèi)存中便于隨時(shí)調(diào)用和分析，同時(shí)原始結(jié)果均以數(shù)據(jù)形式保存，保證了結(jié)果的可靠性、完整性和可追溯性，在安全供血和舉證方面有積極的意義，已被血型檢測標(biāo)本量大的采供血機(jī)構(gòu)血液篩查實(shí)驗(yàn)室廣泛使用[4]。

目前ABO血型的初篩和鑒定過程復(fù)雜，各個(gè)環(huán)節(jié)都可能造成漏檢，如試劑的批間差異、全自動(dòng)血型儀初篩的局限性，檢測人員的個(gè)體差異以及亞型復(fù)雜的表型特征也是造成漏檢的原因[5]，采供血機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)科為保證血型檢測的準(zhǔn)確和及時(shí)，制訂了嚴(yán)格的檢測和疑難血型的送檢流程，便于發(fā)現(xiàn)因正反定型不相符、弱凝集、全凝集等導(dǎo)致血型檢測異常情況，盡可能避免罕見亞型漏檢。

B(A)血型是具有與cisAB相似的順式遺傳方式的罕見ABO亞型，目前共有7種B(A)等位基因，國內(nèi)報(bào)道B(A)02、B(A)04、B(A)05和B(A)06共4種，B(A)04的基因頻率最高為1.6/100 000，其次是B(A)02頻率為0.78/100 000[6]，本研究的血型是中國人群中常見的B(A)04，在經(jīng)典的血清學(xué)檢測中是不能區(qū)別具體是哪種亞型，需要通過分子生物學(xué)檢測才能確認(rèn)具體的亞型型別。B(A)血型分子機(jī)制是由于單堿基突變，在B基因基礎(chǔ)上發(fā)生錯(cuò)義突變，形成具有編碼A抗原和B抗原雙功能活性酶的能力，紅細(xì)胞上同時(shí)表達(dá)弱的A抗原和強(qiáng)的B抗原，血清學(xué)特點(diǎn)是紅細(xì)胞能與抗-B發(fā)生強(qiáng)凝集，與抗-A發(fā)生弱凝集或不凝集，血清中含有抗-A，能凝集或部分凝集A2紅細(xì)胞，表現(xiàn)為A弱B，因獨(dú)特血清學(xué)特點(diǎn)，易在血清學(xué)檢測中發(fā)生漏檢[6-8]。研究報(bào)道cisAB和B(A)與A或B基因雜合的獻(xiàn)血者漏檢頻率約為82.8%，cisAB和B(A)與O基因雜合是漏檢頻率約為11.8%[9]，單純依靠血清學(xué)方法無法準(zhǔn)確鑒定cisAB和B(A)亞型，需要進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，才能得到正確的血型結(jié)果。

通過對(duì)本例B(A)血型的鑒定和原因分析，發(fā)現(xiàn)檢驗(yàn)科使用全自動(dòng)血型檢測系統(tǒng)PK7300進(jìn)行血型檢測時(shí)，通過血型分析儀參數(shù)的設(shè)定和制訂的檢測策略能檢出部分有問題的血型，而部分罕見亞型因方法學(xué)的局限性、試劑間的差異和亞型血清學(xué)特點(diǎn)的多態(tài)性，不能被有效檢出，漏檢的情況時(shí)有發(fā)生。因此有必要在篩查實(shí)驗(yàn)室對(duì)血型檢測試劑的質(zhì)量進(jìn)行充分有效地評(píng)估和獻(xiàn)血者ABO亞型血地篩查，在現(xiàn)有基礎(chǔ)上制訂更加有效的篩查策略。