曾慶雪，周 明，唐柳生

廣西壯族自治區(qū)胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西柳州 545005

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群引起的慢性傳染病，是我國(guó)的乙類傳染病，以炎性滲出、增生和干酪樣壞死為主要病理表現(xiàn)。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的報(bào)告指出，結(jié)核病是世界上最重要的傳染性疾病之一[1]。結(jié)核病主要影響肺部，但也會(huì)影響身體的其他部位，需及早診斷和治療，大多數(shù)可以預(yù)防。有關(guān)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，我國(guó)約有93萬(wàn)人感染了結(jié)核分枝桿菌[2]，特別是肺結(jié)核排菌患者將菌排出體外，通過(guò)空氣傳播，以致他人感染。目前檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌最經(jīng)濟(jì)的方法還是傳統(tǒng)涂片法，現(xiàn)就痰標(biāo)本涂片用熒光顯微鏡人工閱片(簡(jiǎn)稱人工閱片)和自動(dòng)掃描儀檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院疑似為結(jié)核病患者的133例合格痰標(biāo)本(膿痰47例，血痰9例，黏液痰77例)，同時(shí)進(jìn)行抗酸桿菌涂片和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。

1.2儀器與試劑 寧波舜宇儀器有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌FS400顯微鏡掃描系統(tǒng)(簡(jiǎn)稱FS400)、寧波舜宇儀器有限公司生產(chǎn)EX30/DMEX30生物熒光顯微鏡。珠海貝索金胺O染色液、珠海貝索中性羅氏培養(yǎng)基、珠海貝索抗酸染色液(萋尼氏法)、N-乙酰-L半胱氨酸-氫氧化鈉(NALC-NaOH)混合溶液(等體積6%的NaOH溶液和2.9%的檸檬酸鈉溶液混合，每100 mL混合溶液加入0.5 g NALC粉末溶解)，pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液。

1.3方法

1.3.1結(jié)核分枝桿菌涂片 用經(jīng)高壓滅菌的竹簽挑取可疑部分痰液進(jìn)行涂片，自然干燥后金胺O熒光染色：(1)標(biāo)本滴加金胺O染液染色15 min，水洗。(2)3%鹽酸乙醇溶液脫色1～2 min或至無(wú)色，水洗。(3)加復(fù)染劑(0.5%高錳酸鉀溶液)復(fù)染2～4 min，水洗。(4)干燥后在暗室鏡檢：首先以10×目鏡、20×物鏡進(jìn)行鏡檢，發(fā)現(xiàn)疑為抗酸桿菌，使用40×物鏡確認(rèn)。

1.3.2FS400閱片與人工閱片 經(jīng)金胺O熒光染色好的133份痰標(biāo)本涂片用EX30/DMEX30生物熒光顯微鏡進(jìn)行人工閱片，做好記錄，人工閱片完畢后再放至FS400閱片，結(jié)果出來(lái)后，把兩種方法閱片結(jié)果登記并進(jìn)行比較。

1.3.3結(jié)核分枝桿菌的羅氏固體培養(yǎng)觀察過(guò)程 在生物安全柜內(nèi)將2～5 mL痰標(biāo)本放入離心管；向離心管內(nèi)加1～2倍體積的NALC-NaOH混合溶液，渦旋振震蕩后消化15 min直至充分液化；向離心管中加入磷酸鹽緩沖液至45 mL，擰緊蓋子，低溫離心機(jī)(8～10 ℃)，3 000×g，離心15 min；取出離心管，小心棄去上清液，加入1 mL磷酸鹽緩沖液，混勻；把中性羅氏培養(yǎng)基多余的凝固水棄去，每份標(biāo)本接種兩只培養(yǎng)基，每支培養(yǎng)基接種0.10～0.15 mL(2～3滴)，布滿培養(yǎng)基表面。統(tǒng)計(jì)所有結(jié)果，對(duì)培養(yǎng)長(zhǎng)菌標(biāo)本進(jìn)行涂片，采用萋尼染色確認(rèn)培養(yǎng)陽(yáng)性的結(jié)果。

1.3.4菌株涂片進(jìn)行萋尼染色 (1)菌膜自然干燥后固定，滴加石炭酸復(fù)紅染液蓋滿玻片，加熱至出現(xiàn)蒸汽后，停止加熱，染色 5 min，染色期間始終保持菌膜被染液覆蓋，水洗瀝干。(2)滴加5%鹽酸乙醇溶液脫色1～2 min或至無(wú)可視紅色染液為止，水洗瀝干。(3)滴加亞甲藍(lán)復(fù)染30～60 s，沖去染液，干燥后鏡檢。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1133例痰標(biāo)本采用 FS400和人工閱片檢測(cè)的陽(yáng)性率比較 133例痰標(biāo)本 FS400掃描出陽(yáng)性53例，陽(yáng)性率為39.8%(53/133)，人工閱片檢出陽(yáng)性34例，陽(yáng)性率為25.6% (34/133)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.080，P=0.014)。

2.2FS400和人工閱片檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 兩種方法閱片，結(jié)果的一致率為84.2%(112/133)，見(jiàn)表1。

表1 FS400和人工閱片檢測(cè)結(jié)果比較(n)

2.3兩種方法檢測(cè)結(jié)果不一致者與羅氏固體培養(yǎng)結(jié)果的分析 FS400掃描陽(yáng)性而人工閱片陰性的結(jié)果中，羅氏固體培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性5例；FS400掃描陰性而人工閱片陽(yáng)性1例，且羅氏固體培養(yǎng)結(jié)果為陽(yáng)性。

2.4羅氏固體培養(yǎng)與FS400、人工閱片結(jié)果的比較 以羅氏固體培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)S400檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的靈敏度和特異度分別為88.4%(38/43)和83.3%(75/90)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為71.7%(38/53)和93.8%(75/80)；人工閱片檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的靈敏度和特異度分別為79.1%(34/43)和100.0%(90/90)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為100.0%(34/34)和 90.9%(90/99)。

3 討 論

結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)工具有很多，但使用最廣泛的是痰涂片鏡檢，在低收入和中等收入國(guó)家，使用傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡進(jìn)行痰涂片鏡檢是診斷肺結(jié)核的主要方法[3]，為保證顯微鏡檢查的質(zhì)量，結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程規(guī)定：每天一名鏡檢人員的涂片閱讀量不應(yīng)超過(guò)25張[4]，閱片量遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了臨床的需求與日益增加的標(biāo)本量。人們已經(jīng)嘗試采用從顯微鏡下的痰涂片圖像中識(shí)別結(jié)核桿菌[5]，自動(dòng)閱片掃描儀的使用對(duì)我國(guó)控制和及時(shí)治療結(jié)核病提供了很大的幫助。快速檢測(cè)結(jié)核病對(duì)我國(guó)控制及治療結(jié)核病至關(guān)重要。結(jié)核病病原體結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)技術(shù)的不斷改革：從萋尼染色到金胺O染色法，提高了陽(yáng)性率和特異度[6]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)S400閱片陽(yáng)性率(39.8%)高于人工閱片陽(yáng)性率，李強(qiáng)等[7]研究結(jié)果顯示，掃描儀陽(yáng)性率(32.1%)略高于傳統(tǒng)熒光顯微鏡檢查(31.9%)，檢測(cè)效能較高，在工作量大的實(shí)驗(yàn)室、特別是人員缺乏的實(shí)驗(yàn)室，掃描檢測(cè)技術(shù)可以作為傳統(tǒng)檢查的替代工具。金胺O熒光染色法是一種高效率的檢查方法，但容易受到其他熒光染色物質(zhì)干擾，F(xiàn)S400熒光染色的不足為將非抗酸桿菌也判讀陽(yáng)性，本研究中FS400實(shí)際條數(shù)陽(yáng)性總數(shù)為16份標(biāo)本，人工閱片有14份陰性，占比87.5%(14/16)?？顾釛U菌分離培養(yǎng)是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，因此，抗酸桿菌的培養(yǎng)對(duì)結(jié)核病早期發(fā)現(xiàn)和早期治療控制起到非常重要作用[8]，且培養(yǎng)陽(yáng)性率較涂片高。兩種閱片方法陰陽(yáng)性不一致者與培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果中FS400符合率[83.3%(5/6)]更高，抗酸涂片鏡檢對(duì)菌量要求高，靈敏度低，要求菌量達(dá)(5～10)×103/mL才能檢出，因此涂片鏡檢陽(yáng)性檢出率僅30% 左右[9]，F(xiàn)S400靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值較人工閱片高，基于以上統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，F(xiàn)S400可以作為篩查工具。

影響掃描儀結(jié)果的因素為涂片質(zhì)量，涂片過(guò)厚或過(guò)薄，F(xiàn)S400提示涂片陰性異常，無(wú)法判讀結(jié)果。染色時(shí)間較短，熒光無(wú)法上色會(huì)出現(xiàn)判讀陰性；染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，雜質(zhì)也會(huì)染上熒光，儀器也會(huì)判讀陽(yáng)性。脫色時(shí)間要夠，沖洗一定要干凈，否則儀器會(huì)判讀陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)室操作人員應(yīng)加強(qiáng)培訓(xùn)，保證涂片質(zhì)量的可靠。臨床留取標(biāo)本是檢驗(yàn)結(jié)果可靠的前提[10]，文獻(xiàn)報(bào)道，高質(zhì)量痰標(biāo)本涂片檢查的陽(yáng)性率可達(dá)62%[11]，不合格痰標(biāo)本(唾液)的陽(yáng)性率僅為1%[12]。只有合格標(biāo)本才能得到正確的檢驗(yàn)結(jié)果。

金胺O熒光染色法在低倍鏡下可觀察菌體呈亮綠色，背景黑暗，具有清晰的形態(tài)特征，不容易出現(xiàn)漏檢情況，使鏡檢效率顯著提高,雜質(zhì)在熒光顯微鏡藍(lán)色激發(fā)后，可產(chǎn)生亮綠色熒光，與抗酸桿菌相似，容易與之混淆[13]，鐘麗云[14]及樊曉東等[15]研究顯示，金胺 O 熒光染色法不容易出現(xiàn)漏檢情況，使鏡檢效率顯著提高，可作為診斷結(jié)核病的有效手段。

在結(jié)核病診斷中使用FS400能夠獲得更高的靈敏度。人工閱片時(shí)如果在低倍鏡下見(jiàn)形似抗酸桿菌，尤其是少量分布的形似抗酸桿菌，可調(diào)至高倍鏡，或者由經(jīng)驗(yàn)豐富的鏡檢人員確認(rèn)。FS400陽(yáng)性和異常結(jié)果必須經(jīng)過(guò)人工閱片才更為可靠，F(xiàn)S400減輕了工作人員負(fù)擔(dān)，提高了工作效率，但不能完全替代傳統(tǒng)顯微鏡人工閱片。近年來(lái)，醫(yī)院患者不斷增多，結(jié)核實(shí)驗(yàn)室工作量大幅上升，實(shí)驗(yàn)室空間和工作人員數(shù)量日顯緊張，盡管人工閱片更可靠，但人工閱片的速度較慢，王前等[16]研究也證明自動(dòng)閱片技術(shù)診斷病原學(xué)陽(yáng)性肺結(jié)核的靈敏度高于人工閱片，可用于患者抗酸桿菌的篩查。FS400說(shuō)明書強(qiáng)調(diào)需要注意掃描儀結(jié)果不做最終臨床診斷依據(jù)，用戶根據(jù)實(shí)際掃描圖像進(jìn)行人工判讀，從而確定被檢標(biāo)本的最終結(jié)果，以防止假陰性而出現(xiàn)漏檢。本研究中FS400陰性而人工閱片陽(yáng)性標(biāo)本1例，說(shuō)明FS400出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因此，掃描檢測(cè)技術(shù)需要做進(jìn)一步改善以便更能滿足臨床需求。但FS400檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的靈敏度和特異度較高，自動(dòng)化程度高，值得推廣應(yīng)用。