張嬌弟，馬夢(mèng)婷，張 倩 綜述，劉欣躍，2△ 審校

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院：1.藥物基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室；2.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，甘肅蘭州 730000

外泌體是由多囊體衍生出來(lái)的小膜泡，在供體細(xì)胞和受體細(xì)胞之間穿梭，通過(guò)自分泌或旁分泌的方式促進(jìn)血清和血漿中細(xì)胞間通訊的新模式，其作為細(xì)胞間傳遞信號(hào)的囊泡結(jié)構(gòu)，在腫瘤增殖、侵襲和耐藥中發(fā)揮重要作用。腫瘤來(lái)源的外泌體中含有諸如核酸、脂類和蛋白質(zhì)等生物分子，是腫瘤生物標(biāo)志物和治療載體的潛在來(lái)源，其含有的多種RNAs已逐漸被認(rèn)為是新的生物標(biāo)志物、病理生理介質(zhì)、預(yù)后指標(biāo)，甚至是疾病治療的納米藥物。肝細(xì)胞癌(HCC)是全球第六大最常見(jiàn)的癌癥，也是全球癌癥死亡的第四大原因[1],雖然肝癌的治療方法多種多樣，但肝癌的預(yù)后仍然較差，診斷延遲以及高轉(zhuǎn)移率、復(fù)發(fā)率是導(dǎo)致肝癌預(yù)后不良的主要原因[2]，因此早診斷早治療對(duì)改善肝癌患者預(yù)后極其重要。然而目前還沒(méi)有有效的生物標(biāo)志物和技術(shù)，因此，探索與HCC相關(guān)的分子機(jī)制，開(kāi)發(fā)新的HCC臨床預(yù)防生物標(biāo)志物是迫切需要的?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。肝癌腫瘤微環(huán)境主要由成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，異常的腫瘤微環(huán)境與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。最近的研究表明，HCC中多種信號(hào)通路和細(xì)胞間通訊失調(diào),而外泌體是細(xì)胞間通訊的主要媒介之一，其由多泡體衍生出來(lái)的小膜泡與質(zhì)膜融合后由各種細(xì)胞類型分泌而成。外泌體攜帶許多具有多種生物學(xué)功能的物質(zhì)，包括miRNAs，與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。miRNAs是一種內(nèi)源性非編碼小RNAs，主要存在于真核生物中，研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥中發(fā)揮著重要作用。在HCC中，miRNAs不僅是一種有效的生物標(biāo)志物,還具有調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡和化療藥物敏感性的作用，并能通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因抑制腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[4]。因此進(jìn)一步了解HCC來(lái)源的外泌體中miRNAs對(duì)HCC的及時(shí)診斷和治療具有重要意義。本文旨在綜述肝癌來(lái)源的外泌體中miRNAs在肝癌中的一些潛在調(diào)控機(jī)制及診斷價(jià)值，以期為肝癌的早期診斷和精準(zhǔn)治療提供新的思路。

1 肝癌中miRNAs的表達(dá)

miRNAs有18～25個(gè)核苷酸,通過(guò)抑制靶mRNAs的翻譯有效地調(diào)控基因表達(dá)[5]。研究發(fā)現(xiàn) miRNAs可能具有腫瘤抑制或致癌作用，許多研究已經(jīng)報(bào)道m(xù)iRNAs在包括HCC在內(nèi)的不同腫瘤中異常表達(dá)[6]。在肝癌中，miRNAs可下調(diào)或缺失，包括miRNA-26a、miRNA-29c、miRNA-21[7]及miR-424-5p[8]等；相反,致癌性miRNAs包括miR-10b-5p、miR-18a-5p、miR-215-5p、miR-940[9]、miR-122、miR-148a、miR-1246[10]、miR-1251-5p[11]、miR-378b[12]等在肝癌中過(guò)度表達(dá)。因此肝癌中miRNAs異常表達(dá)可作為其診斷、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的有效生物標(biāo)志物。

2 肝癌來(lái)源的外泌體中miRNAs的作用

2.1參與肝癌轉(zhuǎn)移 轉(zhuǎn)移是HCC患者疾病死亡的主要原因。然而，肝癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)肝癌來(lái)源的外泌體miRNAs可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤血管生成、免疫逃逸、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、耐藥等介導(dǎo)肝癌轉(zhuǎn)移。

2.1.1血管生成 血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的重要過(guò)程，肝癌來(lái)源的外泌體首先通過(guò)調(diào)節(jié)和破壞其靶點(diǎn)的組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腫瘤血管生成，從而促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移[13]。ZHOU等[14]的研究顯示，外泌體miRNA-21可直接靶向磷酸酯酶(PTEN)，導(dǎo)致造血干細(xì)胞中丙酮酸脫氫酶激酶同工酶1(PDK1)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路的激活，并且miR-21高表達(dá)與癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)活化程度高、血管密度高相關(guān)，活化的CAFs通過(guò)分泌血管生成細(xì)胞因子，進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展；此外，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β受體Ⅲ(TGFβRⅢ)是一種普遍表達(dá)的TGF-β共受體，是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤進(jìn)展的調(diào)節(jié)劑，包括肝癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。CHEN等[12]發(fā)現(xiàn)HCC中miR-378b表達(dá)上調(diào)，TGFβRⅢ表達(dá)下調(diào)，miR-378b靶向TGFβRⅢ,miR-378b過(guò)表達(dá)可促進(jìn)血管生成和腫瘤生長(zhǎng)，耗盡miR-378b可干擾肝癌細(xì)胞遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且下調(diào)TGFβRⅢ可逆轉(zhuǎn)miR-378b下調(diào)對(duì)HCC細(xì)胞的影響，因此miR-378b促進(jìn)肝癌細(xì)胞進(jìn)展和血管生成，原因可能與TGFβRⅢ相關(guān)，可為肝癌的治療提供藥物靶點(diǎn)；相反，外泌體miR-451a作為一種抑癌因子，有研究發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)HCC細(xì)胞系和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的凋亡，LPIN1是miR-451a的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過(guò)調(diào)控肝癌細(xì)胞凋亡和血管生成抑制HCC的發(fā)生[11]。

2.1.2免疫逃逸 腫瘤來(lái)源的外泌體可能具有免疫調(diào)節(jié)特性，影響T細(xì)胞功能和腫瘤逃脫免疫監(jiān)視，誘導(dǎo)免疫耐受，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[15]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激在腫瘤進(jìn)展和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用。有報(bào)道稱，肝癌中ER應(yīng)激標(biāo)志物水平與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和PD-L1表達(dá)相關(guān),ER應(yīng)激導(dǎo)致HCC細(xì)胞釋放富含miR-23a-3p的外泌體靶向巨噬細(xì)胞，miR-23a-3p一旦被巨噬細(xì)胞內(nèi)化，可抑制PTEN的表達(dá)，激活磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT通路，上調(diào)PD-L1，進(jìn)一步研究證實(shí)外泌體激活的巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞共孵育可下調(diào)CD8+T細(xì)胞比例，抑制白細(xì)胞介素(IL)-2的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡[16]。將富含miR-146a-5p的外泌體從HCC細(xì)胞(小鼠和人)轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞中也獲得了類似的結(jié)果[17]。因此HCC可能通過(guò)高表達(dá)PD-L1抑制CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，介導(dǎo)免疫逃逸。NK細(xì)胞是人類肝臟免疫系統(tǒng)的另一個(gè)主要組成部分，肝癌細(xì)胞如Hep-3B，可以釋放富含miR-92b的外泌體，通過(guò)限制CD69抑制NK細(xì)胞的作用[18]。NAKANO等[18]分別提取原位肝癌模型大鼠血清和無(wú)外泌體血清，靜脈注射裸鼠，前者血清在致瘤組織中顯示高水平的AFP和過(guò)表達(dá)的miR-92b，而后者未顯示ATP水平異常，ROC曲線證實(shí)，患者血清miR-92b水平對(duì)HCC早期(AUC=0.925)和晚期(AUC=0.761)復(fù)發(fā)具有理想的可預(yù)測(cè)性。從機(jī)制上講，血清CD69作為活化T細(xì)胞的表面抗原之一，不僅參與淋巴細(xì)胞增殖誘導(dǎo)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且作為重要的介質(zhì)參與NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，HCC來(lái)源的外泌體中過(guò)表達(dá)的miR-92b在腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)NK細(xì)胞，參與抑制CD69表達(dá)，拮抗NK細(xì)胞對(duì)HCC的細(xì)胞毒作用，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。

2.1.3細(xì)胞外基質(zhì)重塑 細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分包括膠原蛋白、纖維連接蛋白、糖胺聚糖和蛋白聚糖，它們與腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的表型和功能改變有關(guān)[19]。外泌體通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)重塑改變腫瘤微環(huán)境，最終促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自高轉(zhuǎn)移性HCC的外泌體富含癌蛋白和RNAs，外泌體被正常肝細(xì)胞攝取后，激活PI3K/AKT和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路，誘導(dǎo)活性基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的分泌，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，加速腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[20]；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)參與上皮細(xì)胞極性喪失、細(xì)胞外基質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)移前龕的形成，增強(qiáng)癌細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，有研究發(fā)現(xiàn)外泌體中含有的致癌miRNAs參與了EMT的調(diào)控[21]。然而，外泌體是否促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生及其機(jī)制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)在EMT過(guò)程中，上皮腫瘤細(xì)胞在腫瘤基質(zhì)中CAFs的影響下獲得間充質(zhì)特征，腫瘤細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，進(jìn)入低增殖狀態(tài)，遷移和侵襲能力增強(qiáng)[22]；CAFs作為腫瘤微環(huán)境中最多產(chǎn)的細(xì)胞類型，是轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞的一個(gè)子集，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，ZHANG等[23]從HCC腫瘤組織中提取CAFs和癌旁成纖維細(xì)胞(PAFs)進(jìn)行培養(yǎng)并分離出外泌體，分析發(fā)現(xiàn)，與PAFs相比，CAFs來(lái)源的外泌體miR-320a水平更低，miR-320a可以直接靶向前B細(xì)胞白血病同源盒3，抑制MAPK信號(hào)通路的激活，從而抑制轉(zhuǎn)移，這表明miR-320a水平的降低可能促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)移。最近的一項(xiàng)研究表明，高轉(zhuǎn)移性肝癌比低轉(zhuǎn)移性肝癌更易將正常成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CAFs[24]，因?yàn)镠CC合并肺轉(zhuǎn)移患者血清外泌體miR-1247-3p水平明顯高于無(wú)肺轉(zhuǎn)移患者，外泌體miR-1247-3p直接靶向β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅲ(B4GALT3)，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞中β1-整合素/NF-κB信號(hào)通路激活,從而將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CAFs，活化的CAFs通過(guò)分泌IL-6、IL-8和促炎細(xì)胞因子促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性和EMT。這些數(shù)據(jù)提示，HCC細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-1247-3p可促進(jìn)炎癥微環(huán)境和肺轉(zhuǎn)移。

2.1.4肝癌耐藥 腫瘤細(xì)胞耐藥使藥物療效降低，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明腫瘤來(lái)源的外泌體可以通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)耐藥。外泌體可將耐藥相關(guān)蛋白和miRNAs運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞，實(shí)現(xiàn)耐藥細(xì)胞與敏感細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥[25]。ZHANG等[4]的研究發(fā)現(xiàn)外泌體miR-199a-3p表達(dá)水平與HCC中順鉑(DDP)耐藥相關(guān)，上調(diào)miR-199a-3p可逆轉(zhuǎn)腫瘤的化療耐藥性，減緩了腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)。同樣LOU等[26]證明miR-199a-3p水平增高與HCC阿霉素(Dox)化療敏感性呈正相關(guān)，miR-199a-3p具有調(diào)節(jié)潛在靶標(biāo)、結(jié)合細(xì)胞、抑制細(xì)胞入侵、刺激細(xì)胞凋亡和減弱細(xì)胞功能的能力，其在肝癌耐藥細(xì)胞中內(nèi)化可通過(guò)抑制mTOR通路介導(dǎo)藥物高敏感性,DDP或Dox化療后顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并伴有細(xì)胞凋亡率升高。此外越來(lái)越多的證據(jù)表明外泌體miRNAs參與了索拉非尼耐藥機(jī)制。miR-32-5p在肝癌耐藥組織中過(guò)表達(dá)，耐藥癌癥組織釋放的外泌體將miR-32-5p轉(zhuǎn)移到索拉非尼敏感的HCC細(xì)胞中，通過(guò)抑制緊張素同源物PTEN激活PI3K/AKT通路，從而促進(jìn)血管生成和EMT，介導(dǎo)肝癌的多藥耐藥[27];在HIRAO等[28]的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-125-5p誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞(PLC/PRF5)索拉非尼耐藥，并且PLC/PRF5-miR-125-5p顯示出更高的遷移和侵襲能力，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-125-5p抑制 ataxin-1，從而誘導(dǎo)EMT和腫瘤干細(xì)胞特性。miR-744在索拉非尼耐藥HepG2細(xì)胞來(lái)源的外泌體中表達(dá)降低,當(dāng)使用miR-744過(guò)表達(dá)的外泌體處理時(shí)，HepG2細(xì)胞的增殖顯著受到抑制，索拉非尼耐藥性降低[29]。因此，miR-744在HCC的增殖和化療耐藥性中具有重要作用，血清外泌體miR-744可能作為HCC的生物標(biāo)志物，可為HCC治療提供創(chuàng)新策略。以上表明，miRNAs的表達(dá)狀態(tài)將成為HCC患者治療選擇有效藥物的標(biāo)志物。

2.2作為肝癌早期診斷的生物標(biāo)志物 早期發(fā)現(xiàn)HCC對(duì)于治療和改善其預(yù)后至關(guān)重要，然而早期發(fā)現(xiàn)HCC具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)樵摬⊥ǔo(wú)癥狀進(jìn)展。超聲雖為肝癌監(jiān)測(cè)的首選方法，但存在診斷準(zhǔn)確性低等局限。甲胎蛋白(AFP)為肝癌最常用的血清學(xué)檢測(cè)，但對(duì)早期HCC診斷的敏感性較低[30]。超聲與AFP聯(lián)合使用雖然可以提高檢出率，但可能增加假陽(yáng)性和成本，其他腫瘤生物標(biāo)志物，如凝集素結(jié)合的AFP、磷脂酰肌醇聚糖3、高爾基體蛋白73等，也不能有效提高診斷的準(zhǔn)確性[15]。因此，尋找HCC早期檢測(cè)的敏感、特異的生物標(biāo)志物極其重要。液體活檢是一種無(wú)創(chuàng)的癌癥診斷方法，近年來(lái)受到廣泛關(guān)注，循環(huán)腫瘤細(xì)胞和循環(huán)腫瘤DNA是最常用的液體活檢方法，外泌體miRNAs也被認(rèn)為是液體活檢標(biāo)本[31]。SOROP等[30]的研究表明，HCC患者來(lái)源的外泌體中miR-21-5p上調(diào)，miR-92a-3p下調(diào)，基于AFP診斷HCC的AUC為0.72，將AFP、外泌體miR-21-5p、miR-92a-3p 納入HCC診斷的Logistic回歸方程后，其AUC為0.85，顯著優(yōu)于AFP，因此外泌體miR-21-5p和miR-92a-3p可與AFP一起作為篩查HCC的潛在生物標(biāo)志物。ZHANG等[32]的研究顯示3種血清miRNAs (miR-92-3p、miR-107和miR-3126-5p)聯(lián)合AFP可以很好地將早期HCC患者和AFP低水平HCC患者與對(duì)照組區(qū)分開(kāi)來(lái)。另外有研究顯示HCC來(lái)源外泌體中miR-122、miR-148a和miR-1246的表達(dá)水平明顯高于肝硬化組和正常對(duì)照組，但與慢性肝炎組無(wú)明顯差異，miR-148a對(duì)早期HCC和肝硬化的鑒別效果較好(AUC=0.891)，明顯優(yōu)于AFP(AUC=0.712)，且miR-122、miR-148a和AFP聯(lián)合使用可進(jìn)一步提高AUC至0.931，miR-122是區(qū)分HCC和正常對(duì)照組的理想選擇(AUC=0.990)[10]。這些數(shù)據(jù)表明，肝癌來(lái)源的外泌體miRNAs與傳統(tǒng)生物標(biāo)志物的結(jié)合可能進(jìn)一步提升其診斷的準(zhǔn)確性。最近的一項(xiàng)研究綜合分析3種不同的人肝癌RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集miRNAs表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-4661-5p在HCC所有分期(AUC=0.917)，甚至早期(AUC=0.923)均具有良好的診斷性能，其準(zhǔn)確性高于其他候選血清外泌體miRNAs和血清AFP，此外，由外泌體miR-4661-5p和miR-4746-5p組成的外泌體miRNAs面板被認(rèn)為是早期診斷HCC最準(zhǔn)確的生物標(biāo)志物(AUC=0.947)[33]。因此血清中多種外泌體miRNAs的存在為外泌體液體活檢技術(shù)在HCC早期診斷中的臨床應(yīng)用開(kāi)辟了廣闊的前景。

3 小 結(jié)

外泌體作為小型外囊泡，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，了解外泌體的生理功能對(duì)于闡明它們?nèi)绾斡绊懓┌Y進(jìn)展至關(guān)重要。外泌體通過(guò)物質(zhì)運(yùn)輸介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)不同受體細(xì)胞的生理或病理生理過(guò)程。外泌體miRNAs 參與調(diào)控肝癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用，并通過(guò)特定的方法如腫瘤血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、EMT、耐藥和免疫逃逸等介導(dǎo)肝癌的發(fā)展。因此，外泌體miRNAs作為肝癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物或?yàn)槲磥?lái)HCC抗腫瘤策略的靶點(diǎn)提供了一個(gè)新的潛在角度，對(duì)其特異調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究可為肝癌的精準(zhǔn)治療提供潛在靶點(diǎn)。同時(shí)，基于外泌體miRNAs的液體活檢技術(shù)也為多發(fā)性惡性腫瘤的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供了一種無(wú)創(chuàng)、有前景的選擇。盡管外泌體miRNAs具有許多優(yōu)點(diǎn)，但在臨床應(yīng)用中仍面臨一些關(guān)鍵問(wèn)題，如分離和純化方法有局限性，如費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，缺乏大規(guī)模的前瞻性研究，無(wú)法提供液體活檢可以替代腫瘤組織活檢的證據(jù)，產(chǎn)生外泌體miRNAs的細(xì)胞類型不同等，這在臨床上必須加以控制。因此，需要進(jìn)行更多的研究來(lái)解決這些問(wèn)題，并開(kāi)發(fā)出更有效的外泌體miRNAs應(yīng)用于臨床。