宋佳凝，馮國維

陜西省西安市兒童醫(yī)院口腔科，陜西西安 710003

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是口腔癌常見病理分型，起源于口腔黏膜基底細胞層。流行病學調查顯示，國內OSCC的發(fā)病有年輕化趨勢，國內每年約有4.56萬OSCC新發(fā)病例，5年生存率僅30.0%[1]。既往多關注成人OSCC，而有關OSCC在兒童中的報道較少。腫瘤細胞侵襲遷移是OSCC不良預后的高危因素[2]。既往研究證實，微小RNA(miRNA)作為內源性非編碼蛋白質的小分子RNA，參與癌基因的激活或沉默表達，進而調控腫瘤細胞侵襲遷移[3]。報道顯示，miR-382-5p在乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中異常表達[4-5]，推測miR-382-5p可能參與OSCC腫瘤細胞侵襲。抑癌基因張力蛋白同源基因(PTEN)具有蛋白磷酸酶和脂質磷酸酶雙重磷酸酶活性，CHEN等[6]提出miR-382-5p與PTEN存在靶向作用關系，推測這可能是miR-382-5p調控OSCC腫瘤細胞侵襲轉移的機制之一。為驗證上述結果，本研究收集本院12例OSCC患兒臨床資料，并開展基礎試驗研究。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年3月至2021年3月本院收治的12例OSCC患兒作為研究對象，取癌組織和癌旁組織作為檢測標本。納入標準：(1)患兒均經病理活檢確診為OSCC[7]；(2)臨床病例資料完整。排除標準：(1)合并有其他惡性腫瘤者；(2)既往接受放化療或其他抗腫瘤治療者；(3)合并有嚴重心肺基礎疾病或肝腎功能不全者。12例患兒中男7例，女5例；年齡(9.42±3.36)歲；體質量指數(16.73±2.26)kg/m2；腫瘤部位：舌4例，口底3例，軟腭2例，硬腭2例，唇1例；腫瘤分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期3例，Ⅲ期2例；分化程度：低分化6例，中分化5例，高分化1例。

1.2試劑 OSCC細胞CAL-27由中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所提供，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)及胰酶-EDTA購自Gibco公司，D-hanks液購自南京森貝伽生物科技有限公司。轉染試劑盒購自上海賓智生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng)和轉染 采用含10% FBS的DMEM在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中對CAL-27細胞進行培養(yǎng)，取對數生長期細胞，棄培養(yǎng)基后采用D-hanks液洗滌細胞3次，用0.25%胰酶-EDTA消化液消化細胞，在培養(yǎng)皿中進行傳代培養(yǎng)。以對數生長期細胞為轉染對象，種植于培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，在細胞融合度≥50%時進行轉染，以Lipofectamine RNAi Max轉染miR-NC和miR-382-5p抑制物至CAL-27細胞，轉染方法參照轉染試劑盒進行。根據轉染內容不同分為si-NC組(以Lipofectamine RNAi Max轉染miR-NC)和miR-382-5p抑制物組(以Lipofectamine RNAi Max轉染miR-382-5p抑制物)。

1.3.2細胞遷移和侵襲試驗 細胞遷移試驗：取對數生長期細胞，采用無血清培養(yǎng)基對細胞進行培養(yǎng)，12 h后用胰酶-EDTA消化細胞，制備成106個/毫升濃度的細胞基液；分別在Transwell上室和下室加入100 μL細胞懸液和500 μL含10% FBS的DMEM，在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h；取出小室，擦凈后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗；采用4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結晶紫染色；隨機取4～6個視野，計算視野內穿過濾膜細胞數；以平均細胞數為遷移細胞數。細胞侵襲試驗：取0.5 g/L Matrigel 人工基質膠20 μL，置于Transwell上室，在37 ℃條件下孵育4.0 h，Matreigel凝固后去殘留液體，參照遷移試驗方法制備細胞懸液，進行細胞染色，根據干預方法不同將試驗細胞分為miR-382-5p抑制物+si-NC組(轉染miR-382-5p抑制物陰性序列對照)和miR-382-5p抑制物+si-PTEN組(轉染miR-382-5p抑制物+PTEN小干擾RNA)，記錄兩組細胞侵襲遷移數。

1.3.3qPCR檢測 癌組織和癌旁組織解凍后送檢，采用Trizol法提取總RNA，以RNA反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，完成后進行qPCR反應，引物設計見表1，反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，以2-ΔΔCt計算miR-382-5p和PTEN相對表達量。

表1 qPCR引物序列

1.3.4雙熒光素酶試驗 采用Targetscan(http：//www.targetscan.org)對miR-382-5p進行靶基因預測，PTEN mRNA的野生型3′-UTR和突變型3′-UTR連接psi-CHECK-2載體，分別為PTEN-WT和PTEN-MUT(CAL-27細胞共轉染miR-NC或miR-382-5p抑制物200 nmol/L)，根據共轉染對象不同分別記為PTEN-WT+miR-NC組、PTEN-WT+miR-382-5p組、PTEN-MUT-miR-NC組及PTEN-MUT-miR-382-5p組。培養(yǎng)48 h后收集細胞裂解，采用Dual-Luciferase?Report Assay System 雙熒光報告酶檢測系統(tǒng)進行檢測。

2 結 果

2.1兩組細胞侵襲遷移試驗結果 miR-382-5p抑制物組和si-NC組遷移細胞數分別為(178.25±30.29)個和(142.46±26.83)個，兩組侵襲細胞數分別為(253.32±62.08)個和(202.41±54.54)個，兩組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(t=3.064，2.134；P=0.006，0.044)。

2.2miR-382-5p靶基因 通過軟件預測顯示，PTEN可能是miR-382-5p潛在靶基因，見圖1。miR-382-5p和PTEN在癌組織中的相對表達水平分別為0.87±0.31和0.72±0.26，癌旁組織相對表達水平分別為0.62±0.19和0.51±0.20。癌組織和癌旁組織miR-382-5p和PTEN相對表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(t=2.382，2.218；P=0.026，0.037)。雙熒光素酶試驗檢測結果顯示，PTEN-WT+miR-NC組和PTEN-WT+miR-382-5p組熒光活性變化倍數分別為0.87±0.12和0.33±0.09，兩組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.471，P<0.05)，PTEN-MUT-miR-NC組和PTEN-MUT-miR-382-5p組熒光活性變化倍數分別為0.79±0.22和0.77±0.18，兩組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.244，P=0.810)。

注：Targetscan數據庫預測顯示，PTEN 3′UTR存在miR-382-5p結合位點。圖1 Targetscan數據庫預測結果

2.3抑制PTEN表達逆轉miR-382-5p對CAL-27細胞遷移侵襲的影響 miR-382-5p抑制物+si-NC組和miR-382-5p抑制物+si-PTEN組細胞遷移數分別為(170.45±35.56)個和(274.10±81.36)個,細胞侵襲數分別為(138.96±32.25)個和(180.04±25.63)個，兩組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(t=4.044，3.455；P=0.001，0.002)。

3 討 論

腫瘤細胞侵襲遷移是OSCC生長轉移的重要病理基礎，而腫瘤細胞與腫瘤局部微環(huán)境的相互作用與OSCC發(fā)生發(fā)展密切相關，二者共同作為靶點[8]，這將是優(yōu)化OSCC治療方案的重要方向。腫瘤相關成纖維細胞(CAFs)是腫瘤微環(huán)境主要的間質細胞，來源于骨髓間充質干細胞，基礎研究證實CAFs可通過分泌趨化因子、生長因子及細胞外基質，進而加快腫瘤血管內皮細胞增殖，促進腫瘤血管生成[9]。曹娟等[10]還發(fā)現CAFs可通過外泌體調控OSCC細胞生物學行為。因而，本研究選取CAF-27作為OSCC細胞進行試驗。

miRNA作為非編碼單鏈RNA分子，通過與靶mRNA 3′-UTR區(qū)特異性位點結合，降解mRNA，從而調控靶基因，發(fā)揮生物學功能，參與腫瘤癌變[11]。miR-382-5p已被證實在多種惡性腫瘤中存在異常表達，趙樹鵬等[12]發(fā)現miR-382-5p可通過介導PTEN表達，抑制膠質瘤細胞增殖侵襲，而劉冬冬等[13]則發(fā)現miR-382-5p可通過抑制PTEN阻斷白血病NB4細胞分化。PTEN編碼蛋白由N端磷酸酶催化域和C端結構域2個結構域構成，定位于10q23.3染色體，是機體重要抑癌基因，PTEN活性作用可通過磷酸化、泛素化、乙?；榷喾N途徑參與下游基因的調節(jié)，發(fā)揮生物學效應[14]。PORS等[15]也認為PTEN可經細胞核參與細胞染色體DNA的修復，并通過PIK/AKT信號通路，調控腫瘤細胞遷移侵襲。另外，PTEN通過小泛素樣修飾蛋白分子翻譯后途徑參與腫瘤生物學行為[16]。但PTEN是否參與CAF-27細胞分裂增殖，臨床尚未形成定論。

本研究行細胞侵襲遷移試驗，結果顯示，miR-382-5p可促進OSCC細胞侵襲，而雙熒光素酶試驗檢測進一步說明PTEN為miR-382-5p的靶基因，提示miR-382-5p可與PTEN的3′-UTR區(qū)位點結合，進而調控OSCC生長。另外，本研究行細胞轉染和Transwell試驗檢測，結果顯示，miR-382-5p抑制物+si-PTEN組細胞侵襲遷移數顯著增加，這提示抑制PTEN表達可逆轉miR-382-5p抑制物對CAL-27細胞侵襲遷移的抑制作用。此外，本研究收集OSCC患兒癌組織和癌旁組織，采用qPCR法進一步證實miR-382-5p和PTEN在癌組織和癌旁組織中的相對表達水平不同，結果也說明miR-382-5p可能通過調控PTEN參與OSCC病理進程。

綜上所述，miR-382-5p在OSCC患兒中呈高表達，可能通過調控PTEN參與CAL-27細胞的侵襲遷移。