向 彬，田小毛，米 滔，金黎明， 陳美玲， 劉 豐，劉 星，林 濤，魏光輝 400014 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院泌尿外科，兒童泌尿生殖發(fā)育與組織工程重點實驗室，兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室，國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地，兒科學(xué)重慶市重點實驗室

腎母細胞瘤(wilms tumor，WT)是最常見的兒童腎臟惡性腫瘤，在所有兒童惡性腫瘤中約占6%；15歲以下兒童中，發(fā)病率約為7.1/100 000[1]。隨著化療、手術(shù)、放療等多種治療手段的綜合應(yīng)用，總體生存率已經(jīng)超過90%[2]。然而，間變病理類型和復(fù)發(fā)患者的預(yù)后仍然很差[3-5]。進一步探索WT發(fā)生發(fā)展的分子機制對WT患者接受更好的治療、獲得更好的整體預(yù)后具有重要意義。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類新型的非編碼RNA，其主要定位于細胞質(zhì)中，提示它們在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用[6]。然而，circRNA表達譜及其在腎母細胞瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制仍不清楚。既往的研究表明circRNAs調(diào)控腫瘤進展的主要途徑是作為一種競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)，通過miRNA的海綿作用進一步調(diào)節(jié)下游mRNA的表達[7-8]。因此，為了探索circRNA相關(guān)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在腎母細胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中的潛在機制，本研究對臨床來源的腫瘤樣本進行測序分析，鑒定差異表達的circRNAs和mRNAs；并基于自己的測序數(shù)據(jù)構(gòu)建WT中一個潛在的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 腫瘤組織樣本

本研究方案獲得重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批件號：2022年倫審第50號)。收集2021年6月至2022年3月期間重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院泌尿外科的WT患者的腫瘤切除組織。根據(jù)美國兒童腫瘤協(xié)作組(Children’s Oncology Group，COG)標(biāo)準(zhǔn)[9](沒有前期化療)，所有樣本診斷為腎母細胞瘤。如果病理結(jié)果報告神經(jīng)母細胞瘤、橫紋肌樣瘤或透明細胞肉瘤等，則被排除。共納入25例配對的腫瘤及鄰近正常組織標(biāo)本。選擇8對新鮮的腫瘤和配對正常組織進行mRNA測序，獲得腎母細胞瘤中mRNA的表達數(shù)據(jù)；選擇4對配對的腫瘤組織進行circRNA測序，以獲得完整的circRNA表達數(shù)據(jù)。剩余13對配對的腫瘤標(biāo)本被冷凍儲存在液氮中，用于RT-qPCR驗證。

1.2 circRNA測序和mRNA測序

按照提示，用RiboZero rRNA去除試劑盒(Epicentre，WI，USA)處理4對WT樣品的總RNA。將rRNA耗盡和RNase R酶切后的RNA樣品進行片段化，用隨機引物合成cDNA。純化cDNA的PCR擴增產(chǎn)物，用NovaSeq6000(Illumina，San Diego，CA，USA)對RNA文庫進行質(zhì)量控制和測序。使用fastp[10]軟件對序列進行過濾，獲得可用于數(shù)據(jù)分析的“clean reads”。在得到測序讀數(shù)以后，采用CIRI軟件[11]對circRNA進行預(yù)測。在以上預(yù)測的基礎(chǔ)上，根據(jù)circRNA在染色體上的位置信息，合并全部樣本中的circRNA結(jié)果對合并后結(jié)果進行重新編碼ID。而后將其與circBase數(shù)據(jù)庫[12]進行比對，從而識別出已注釋的和新預(yù)測的circRNA。

本次mRNA測序為16個樣本的雙端測序。使用RNeasy mini試劑盒(Qiagen， Germany)提取總RNA。使用TruSeqTMRNA樣品制備試劑盒(Illumina，USA)按照指南合成雙端文庫。純化的文庫用Qubit? 2.0熒光儀(Life Technologies，USA)進行定量，并由Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies， USA)進行驗證，以確認插入物的大小并計算出分子濃度。在Illumina NovaSeq 6000上進行測序。使用FastQC軟件對測序得到的結(jié)果進行質(zhì)量評估。使用FASTX-Toolkit軟件(http://hannonlab. cshl.edu/fastx_toolkit/)對原始序列進行清洗過濾得到“clean reads”。使用Hisat2軟件[13]將得到的“clean reads”比對到已知的參考基因組(GRCh38.91)上。

1.3 circRNA和mRNA的差異表達分析

為了量化mRNA的表達豐度，使用FPKM(Fragments PerKilobase Million)來表征不同基因的表達量，其計算公式如下：

首先使用Stringtie軟件[14]對比對后每個基因區(qū)段內(nèi)的片段進行計數(shù)，然后再使用TMM(trimmed mean of M values)算法進行歸一化，最后再計算每個基因的FPKM值。在得到基因的FPKM表達值以后，使用edgeR軟件包[15]對組間基因表達進行差異分析(配對t檢驗)，得出組間基因表達的P值以及經(jīng)過多重比較檢驗后校正的Q值。同時，根據(jù)FPKM值計算差異表達倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)。DEmRNAs的篩選標(biāo)準(zhǔn)為Q<0.05和|logFC|>2。

無論是新預(yù)測的還是已被數(shù)據(jù)庫注釋的circRNA，目前絕大部分的circRNA都無法獲得其完整的全長序列。只能使用circRNA序列上的“back-splicing”(反向剪切)位點部分的“junction reads”的數(shù)量來作為circRNA表達量的計算依據(jù)。通常使用SRPBM(spliced reads per billion mapping)值來表征circRNA的表達水平[16]， 其計算公式如下：

差異表達分析與mRNA分析策略一樣，也使用edgeR來計算。DEcircRNAs的篩選標(biāo)準(zhǔn)為|FC (fold change)|>2和P<0.05。

1.4 基因本體論(gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

根據(jù)circRNA在基因組上的位置信息，可以獲得與circRNA所在基因組位置上對應(yīng)的蛋白編碼基因的信息，這類基因被稱為某一circRNA的“parental gene”(親本基因)。為了探索circRNA相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)的潛在生物學(xué)機制，使用R“ClusterProfiler”軟件包[17]對DEcircRNA的親本基因和DEmRNA進行基于Gene Ontology，包括生物學(xué)過程(biological process，BP)、細胞成分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)和KEGG途徑的富集分析。P值<0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5 構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

ceRNA假說揭示了一種RNA間相互作用的新機制。mRNA和circRNA可以通過競爭性的結(jié)合miRNA來調(diào)控彼此的表達。miRanda是一種常用于檢測基因組序列中潛在microRNA靶位點的算法[18]。匹配策略主要包括兩個步驟：首先，在查詢的miRNA序列和基因3’UTR序列間進行動態(tài)規(guī)劃局部比對，基于序列互補性(而不是序列一致性)打分；然后，基于第一步獲得的高分比對結(jié)果(sc參數(shù)控制)，使用RNAlib(來自ViennaRNA包)評估比對的熱力學(xué)穩(wěn)定性。最終能量小于閾值的匹配對象作為最終結(jié)果。在前面的結(jié)果中，獲得了差異表達的circRNA和mRNA。使用miRanda鑒定差異circRNA和mRNA的microRNA靶點，初步匹配條件為序列互補Tot Score>140和熱力學(xué)穩(wěn)定性Tot Energy<-20。然后篩選出與miRNAs共調(diào)控的DEmRNA和DEcircRNA。利用miRanda回歸模型分析以及序列匹配的方法(篩選條件設(shè)置為Sum max energy<-90)建立miRNAs的海綿吸附作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。最后根據(jù)DEcircRNAs與對應(yīng)DEmRNAs的協(xié)同表達來找到核心的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)。并用Cytoscape軟件v.3.8.2[19]進行可視化。

1.6 基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)

GSEA用于確定預(yù)先定義的基因集合在兩種生物狀態(tài)(如腫瘤和正常組織)之間是否顯示出統(tǒng)計學(xué)差異[20]。基于“Molecular Signatures Database v7.4”，利用GSEA分析差異基因的潛在途徑?；凇癱urated gene sets”確定豐富的KEGG途徑、生物學(xué)過程、細胞成分和分子功能。最后，基于“immunologic signature gene sets”確定與腫瘤系統(tǒng)中細胞活性和應(yīng)答相關(guān)的特定生物學(xué)狀態(tài)或過程。根據(jù)默認的加權(quán)富集統(tǒng)計方法對數(shù)據(jù)進行歸一化，以獲得歸一化富集得分(NES)。|NES|>2和P<0.05的基因集被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.7 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-Protein Interaction Networks，PPI)的構(gòu)建和HUB基因的鑒定

使用中等置信度(0.400)的交互得分，利用在線網(wǎng)站STRING[21-22]構(gòu)建了一個基于ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中靶基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行可視化。隨后，使用cytoHubba 插件[23]識別前10個HUB基因。

1.8 基于HUB基因的預(yù)后價值構(gòu)建關(guān)鍵的circRNA調(diào)控子網(wǎng)絡(luò)

TARGET數(shù)據(jù)庫是目前最大的兒童腫瘤綜合數(shù)據(jù)庫。本研究從中下載了136個WT樣本的RNA測序數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床信息數(shù)據(jù)集。在生存結(jié)果分析中，根據(jù)HUB基因表達值的中位數(shù)將患者分為高表達組和低表達組。選擇無病生存率(disease free survival，DFS)作為主要隨訪終點，使用Kaplan-Meier方法和基于TARGET數(shù)據(jù)集表達譜的單因素Cox回歸分析來評估HUB基因的預(yù)后價值。最后，基于關(guān)鍵的HUB基因構(gòu)建WT中的circRNA調(diào)控子網(wǎng)絡(luò)。

1.9 RNA測序結(jié)果的PCR驗證

使用Trizol試劑(Invitrogen， Carlsbad， CA， USA)提取每個腫瘤組織的RNA。根據(jù)制造商的說明，使用Simply P Total RNA Extraction Kit(BioFlux， China)提取細胞總RNA。使用NanodropOne(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，United States)測定RNA濃度。使用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa， Japan)對circRNA和mRNA進行反轉(zhuǎn)錄，并使用TB Green? PremixExTaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa，Japan)進行擴增和定量。實時PCR在CFX Connect Real-Time PCR Detection System上操作。每個樣本包含3個技術(shù)重復(fù)。GAPDH用于circRNA和mRNA表達的標(biāo)準(zhǔn)化。目標(biāo)基因的表達基于2-ΔΔCt公式計算。本研究使用的引物見表1。

表1 RT-qPCR引物

1.10 功能喪失實驗

本研究選擇hsa_circ_0009035在WT細胞系中進一步驗證功能。針對hsa_circ_0009035后剪接位點的siRNA和陰性對照由Hanbio(上海，中國)設(shè)計并合成。使用脂質(zhì)體2000 (Invitrogen，美國)進行細胞轉(zhuǎn)染。根據(jù)制造商的說明步驟，采用CCK-8法(MCE，HY-K0301)檢測細胞活力，并采用劃痕法檢測細胞遷移。使用基質(zhì)凝膠(Biozellen，B-P-00002-4，中國)敷在24孔板小室(Falcon，353097，美國)中進行Transwell檢測細胞侵襲。使用BD細胞周期檢測試劑盒和流式細胞儀檢測細胞周期時相分布。

1.11 數(shù)據(jù)分析

配對組織樣本的基因表達差異分析采用配對t檢驗(正態(tài)分布)或Wilcoxon配對檢驗(非正態(tài)分布)。使用GraphPad Prism 8對PCR實驗結(jié)果進行分析。 所有的生物信息學(xué)分析使用R軟件4.0.3版進行。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 WT中差異表達的circRNA和mRNA鑒定

對4對腎母細胞瘤和配對正常組織樣本進行circRNA測序，共鑒定出23 978個circRNA，其中10 884個circRNA在circBase(http://www.circbase.org/)數(shù)據(jù)庫中已獲得注釋(圖1A)。另外，結(jié)果顯示大多數(shù)circRNA(84.18%)由外顯子組成，11.72%由內(nèi)含子組成，而4.10%定位于基因間區(qū)(圖1B)。這里排除了來自基因間區(qū)的circRNA(目前認為該類circRNA無功能)。通過熱圖顯示了篩選到的DEcircRNA的特異性表達(圖1C)，層次聚類分析顯示在WT中大多數(shù)DEcircRNA低表達。DEcircRNA的分布通過火山圖顯示(圖1E)，總共鑒定出314個DEcircRNA，其中115個上調(diào)、199個下調(diào)。同樣，本研究額外對8對配對的腎母細胞瘤組織進行了測序，分析了mRNA表達譜。根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，檢測到1 030個上調(diào)和582個下調(diào)差異表達基因。圖1D展示了腫瘤和正常組織的基因表達熱圖，圖1F展示了差異表達基因的火山圖。

表2 擬PCR驗證的DEcircRNA的基本特征

圖1 基于RNA高通量測序分析WT中差異表達circRNA和mRNA

為了驗證circRNA測序結(jié)果，隨機選擇了12個DEcircRNA(8個上調(diào)，4個下調(diào))設(shè)計了跨越circRNA后剪接位點的特異性發(fā)散引物進行組織驗證(DEcircRNA的詳細特征見表2)。RT-qPCR結(jié)果顯示其中7個DEcircRNA顯示出顯著的表達差異(圖2)。

a：P<0.05，b：P<0.01；紅點代表腫瘤樣本，藍點代表正常樣本

2.2 DEmRNA和DEcircRNA親本基因的GO和KEGG途徑富集分析

為了發(fā)現(xiàn)DEcircRNA和DEmRNA的潛在功能，對DEcircRNA親本基因和DEmRNA分別進行GO注釋和KEGG通路富集分析。DEcircRNA親本基因GO和KEGG通路富集分析結(jié)果如圖3A、C。GO注釋分析表明DEcircRNA親本基因主要定位于細胞質(zhì)和外泌體，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖和細胞周期等過程。KEGG途徑富集分析表明，DEcircRNA親本基因主要富集在多條癌癥相關(guān)的途徑中。此外，本研究對DEmRNA同樣進行基于GO和KEGG的富集分析。對于GO注釋(圖3B)，與惡性表型相關(guān)的生物學(xué)過程顯著豐富，包括DNA復(fù)制、細胞分裂、細胞周期和細胞增殖等過程。KEGG途徑(圖3D)富集分析表明，DEmRNA主要集中在細胞增殖、代謝和生長的信號通路上，另外腫瘤相關(guān)信號通路如P53信號通路和多條代謝通路也得到了富集。

A：DEcircRNA親本基因的GO富集分析；B：DEmRNA的GO富集分析；C：DEcircRNA親本基因的KEGG富集分析；D：DEmRNA的KEGG富集分析

2.3 WT中circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了預(yù)測所有DEcircRNA和DEmRNA的潛在靶點miRNA，使用miRanda預(yù)測工具分別識別314個DEcircRNA和1 612個DEmRNA的miRNA靶點。構(gòu)建了DEcircRNA-miRNA和DEmRNA-miRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖4A、B)。通過整合circRNA-miRNA對和miRNA-mRNA對，基于相同miRNA結(jié)合位點構(gòu)建了一個完整的circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)ceRNA理論，本研究選擇circRNA和mRNA具有協(xié)同表達趨勢的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，并將篩選條件設(shè)置為Sum max energy<-90(絕對值越大越嚴格)。最終，構(gòu)建了一個精確的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中包括62個circRNA、8個miRNA和127個mRNA，并隨后通過Cytoscape進行可視化(圖4C、D)。

A：circRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；B：miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；C：circRNA和mRNA的miRNA靶點交集；D：ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.4 ceRNA網(wǎng)絡(luò)中靶基因的GSEA富集和PPI網(wǎng)絡(luò)分析

為了研究ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在WT中的潛在生物學(xué)功能，基于所涉及的127個DEmRNA進行GSEA分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DEmRNA的富集通路見圖5A，尤其是主要與細胞周期相關(guān)。值得注意的是，基于免疫背景基因集的富集分析顯示DEmRNA與多種免疫細胞的活性有關(guān)(圖5B)。結(jié)果表明，這些DEmRNA在一定程度上參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，特別是與細胞周期和免疫應(yīng)答有關(guān)。為了探索關(guān)鍵的HUB基因，基于STRING數(shù)據(jù)庫建立了包含127個點和170個連接的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖5C)。前10個HUB基因，包括TP53、KANK3、STIL、RRM2、HELLS、POLE2、TOP3A、LLGL1、GMPS和GTPBP4被鑒定(圖5D)。

A：基于C5策劃基因集對ceRNA網(wǎng)絡(luò)中DEmRNA的GSEA分析；B：基于免疫特征基因集對ceRNA網(wǎng)絡(luò)中DEmRNA的GSEA分析；C：ceRNA網(wǎng)絡(luò)中DEmRNA的PPI網(wǎng)絡(luò)；D：通過cytoHubba插件鑒定前10個HUB基因

2.5 基于HUB基因的預(yù)后特征構(gòu)建關(guān)鍵的ceRNA調(diào)控子網(wǎng)絡(luò)

在鑒定的前10個HUB基因中，除KANK3外，其余HUB基因都呈表達上調(diào)趨勢(圖6A)。為驗證HUB基因的預(yù)后價值，通過單因素COX回歸分析10個HUB基因?qū)T患者遠期生存率的影響(圖6B)。結(jié)果顯示4個HUB基因包括TP53、KANK3、LLGL1和TOP3A的mRNA表達水平與WT患者的RFS(無病生存率)顯著相關(guān)(圖6C)。結(jié)果提示這4個基因可能在WT的進展和預(yù)后中起關(guān)鍵作用。最后，基于這4個HUB基因的重要性，進一步構(gòu)建了靶向該基因的子網(wǎng)絡(luò)(圖6D)。RT-qPCR用于驗證4個HUB基因的表達水平，結(jié)果顯示出與測序數(shù)據(jù)一致的趨勢(圖6E)。

A：前10個HUB基因表達變化柱狀圖(紅色柱代表上調(diào)基因，藍色柱代表下調(diào)基因)；B：森林圖顯示單因素Cox回歸分析中HUB基因的mRNA表達水平與WT患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)；C：與WT患者預(yù)后顯著相關(guān)的4個HUB基因的生存曲線；D：基于4個與預(yù)后顯著相關(guān)的HUB基因構(gòu)建ceRNA調(diào)控子網(wǎng)絡(luò)；E：對關(guān)鍵HUB基因的RT-qPCR驗證 紅點代表腫瘤樣本，藍色代表正常樣本；a：P<0.01

2.6 沉默hsa_circ_0009035抑制WT細胞的增殖、侵襲和遷移

本研究選擇子網(wǎng)絡(luò)中的hsa_circ_0009035進行進一步的功能驗證。如前所述，與鄰近的非腫瘤組織相比，hsa_circ_0009035在WT組織中高表達。PCR產(chǎn)物的Sanger測序驗證了其反向剪接位點(圖7A)。為了研究hsa_circ_0009035在WT進展中的作用，本研究設(shè)計了特異性沉默hsa_circ_0009035的siRNA。siRNA片段通過靶向hsa_circ_0009035的反向剪接位點敲低目的環(huán)狀RNA的表達水平。與陰性對照相比，hsa_circ_0009035的沉默顯著降低了WIT-49細胞中的RNA水平(圖7B)。通過CCK-8實驗，沉默hsa_circ_0009035顯著抑制了WT細胞的增殖能力(圖7C)。此外，沉默hsa_circ_0009035后，細胞的遷移和侵襲能力下降(圖7D、E)。細胞周期分布分析顯示，hsa_circ_0009035沉默后，G1期細胞比例明顯減少，S期細胞比例增加(圖7F)。以上結(jié)果表明構(gòu)建的環(huán)狀RNA網(wǎng)絡(luò)在WT進展中具有潛在作用。

a：P<0.05，b：P<0.01

3 討論

當(dāng)前對WT的治療已取得進展，但影響其發(fā)生和發(fā)展的具體機制仍不明確，特別是在circRNA領(lǐng)域。因此，探討WT發(fā)生發(fā)展的分子機制，并識別有效的生物標(biāo)志物對WT患者更好的治療和更好的整體預(yù)后具有重要意義。近年來，ceRNA網(wǎng)絡(luò)假說引起了研究者的極大興趣，它將蛋白質(zhì)編碼的mRNA與非編碼的RNA聯(lián)系起來。根據(jù)ceRNA假說，circRNA可以作為miRNA海綿來影響下游mRNA的表達[15-16]。越來越多的證據(jù)表明，circRNA及其介導(dǎo)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在多種人類癌癥的發(fā)病和進展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[24]。例如，hsa_circ_0014130作為miR-132-3p的海綿，通過調(diào)控KCNJ12的表達，促進膀胱癌的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[25]；circAGFG1作為miR-195-5p的海綿，通過調(diào)節(jié)CCNE1的表達，促進三陰性乳腺癌的進展[26]。因此，為了探索circRNA相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)在WT發(fā)生發(fā)展過程中的潛在機制，本研究基于臨床腫瘤樣本的測序數(shù)據(jù)構(gòu)建了WT中一個潛在的circRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

3.1 RNA測序揭示W(wǎng)T中circRNA和mRNA的差異表達

到目前為止，還沒有研究報道WT腫瘤和正常組織之間DEcircRNA的全面表達。通過下一代測序技術(shù)本研究系統(tǒng)性地分析了WT的circRNA表達譜。通過circBase數(shù)據(jù)庫比對，超過一半的circRNA(54.61%)為新發(fā)現(xiàn)。根據(jù)方法中的篩選標(biāo)準(zhǔn)，共檢測到314個DEcircRNA(115個上調(diào)，199個下調(diào))。為了驗證測序結(jié)果，本研究隨機選擇了12個DEcircRNA在臨床腫瘤組織中進行RT-qPCR驗證，結(jié)果其中7個DEcircRNA呈現(xiàn)出與測序結(jié)果一致的表達趨勢。另外，本研究也分析了WT腫瘤和配對正常組織之間的mRNA差異表達，共檢測到1 612個DEmRNA(1 030個上調(diào)，582個下調(diào))。有趣的是大多數(shù)DEcircRNA(63.38%)下調(diào)，而大多數(shù)DEmRNA(63.90%)上調(diào)。這些結(jié)果暗示一個復(fù)雜的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

GO富集和KEGG途徑分析表明，DEcircRNA親本基因富集到多條癌癥相關(guān)的途徑中，參與細胞增殖和細胞周期等惡性生物學(xué)相關(guān)過程。GO-CC分析提示DEcircRNA親本基因主要定位于細胞質(zhì)中。一般認為，大部分外顯子來源的circRNA主要定位在細胞質(zhì)中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能。值得一提的是外泌體中也有大量富集。最近的研究揭示了circRNA在外泌體中具有穩(wěn)定的富集[27]。不僅如此，越來越多的研究表明外泌體來源的circRNA在多種腫瘤中充當(dāng)預(yù)后標(biāo)志物，并調(diào)控腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥[28-32]。以上證據(jù)支持circRNA通過外泌體運輸?shù)姆绞絽⑴c調(diào)控WT的腫瘤微環(huán)境。GO和KEGG通路分析也用于注釋W(xué)T中的DEmRNA。結(jié)果顯示DEmRNA參與調(diào)控細胞分裂、細胞周期、細胞增殖以及代謝和經(jīng)典的P53通路等生物過程，這些信號通路已被證實可以調(diào)節(jié)細胞的行為和結(jié)局。結(jié)果表明，DEcircRNA和DEmRNA在多種癌癥相關(guān)功能通路中起著關(guān)鍵作用，并進一步表明circRNA相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)可能參與了WT的發(fā)生和發(fā)展。

3.2 WT中circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA可以作為miRNA海綿間接調(diào)控基因表達。因此，為了揭示DEcircRNA在WT中的詳細作用和機制，本研究整合了circRNA-miRNA和mRNA-miRNA相互作用對，構(gòu)建了由62個circRNA、8個miRNA和127個mRNA組成的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。為了了解ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的mRNA靶點在WT發(fā)生和發(fā)展中的潛在途徑和生物學(xué)功能，本研究進行了GSEA分析。GSEA可以檢測基因集合而不是單個基因的富集途徑。富集結(jié)果主要與細胞周期有關(guān)。值得注意的是，這些mRNA靶點還富集到多種免疫細胞活性路徑。如上所述，結(jié)果表明ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的mRNA靶點可能通過細胞周期和免疫途徑調(diào)控WT的發(fā)生發(fā)展。

為了進一步確定關(guān)鍵的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，基于STRING數(shù)據(jù)庫建立了PPI網(wǎng)絡(luò)，并篩選了10個HUB基因。除了KANK3在WT下調(diào)外，其余HUB基因均呈上調(diào)。單因素Cox分析發(fā)現(xiàn)，ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的靶分子TP53、KANK3、LLGL1和TOP3A是WT患者預(yù)后不良的危險因素。進一步表明它們在WT進展中具有重要的生物學(xué)作用。

3.3 體外實驗驗證circRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的潛在功能

通過在PubMed上搜索這些基因，本研究發(fā)現(xiàn)既往的研究已經(jīng)報道了他們在惡性腫瘤發(fā)生中的可能機制。TP53在多種癌癥中均有高表達，并可作為多種癌癥的診斷和預(yù)后標(biāo)志物[33]。此外P53也被報道作為circRNA的調(diào)控靶點，例如一項最近的研究顯示circCNTNAP3的過表達抑制了P53野生型食管鱗狀細胞癌 ESCC 細胞的增殖同時增加細胞凋亡，機制上通過海綿miR-513a-5p從而促進P53的表達[34]。相對而言，KANK3的研究較少，KIM等[35]發(fā)現(xiàn)KANK3的下調(diào)增強了肝細胞癌的細胞遷移和侵襲，生物信息學(xué)分析表明KANK3下調(diào)與多種癌癥的不良預(yù)后相關(guān)。有趣的是，KANK3已被確定為P53的缺氧誘導(dǎo)的促凋亡靶點[36]。LLGL1也被稱為Lgl1、HUGL1或HUGL-1。該基因已被報道通過調(diào)節(jié)細胞增殖、侵襲、細胞凋亡和化療藥物耐藥性等生物學(xué)過程在多種惡性腫瘤中發(fā)揮致癌作用，比如胰腺導(dǎo)管癌[37]、非小細胞肺癌[38]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[39]和食管癌[40]。LLGL1還被報道作為多種癌癥的預(yù)后標(biāo)志物[41-44]。TOP3A編碼一種DNA拓撲異構(gòu)酶。有研究報道了該基因在癌癥中的作用，例如該基因與P53相互作用并有助于P53介導(dǎo)的腫瘤抑制[45]。另一項研究則發(fā)現(xiàn)TOP3A的表達與口腔鱗狀細胞癌癌癥干細胞和免疫表型之間存在相關(guān)性，然而并未顯示出該基因在口腔鱗狀細胞癌中的預(yù)后意義[46]。最后，基于關(guān)鍵HUB基因的重要性，使用RT-qPCR在臨床來源的腫瘤組織中驗證了他們的差異表達水平。此外，功能分析顯示，hsa_circ_0009035的沉默抑制了WT細胞的增殖、侵襲和遷移，提示hsa_circ_0009035在WT細胞惡性進展中的作用。這些發(fā)現(xiàn)有力地證明了環(huán)狀RNA在WT中不可或缺的作用。

本研究確定了WT中的circRNA表達譜并構(gòu)建了circRNA相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)可能參與調(diào)控WT的發(fā)生發(fā)展。本研究為闡明WT的發(fā)病機制提供了新的見解，并提出了值得進一步研究的潛在調(diào)控機制。