童潮旭，張 濤，龔惠英，毛偉靈，李龍浩 400016 重慶，重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科

大腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界上常見的惡性腫瘤之一，按部位可分為結(jié)腸癌和直腸癌，其中直腸癌約占60%以上[1]。臨床實踐中，直腸癌患者就診時往往已屬中晚期[2]，而放射治療在中晚期直腸癌的治療中有著重要地位。術前放療能縮小腫瘤的體積，降低其臨床分期，為患者爭取根治性切除的機會，并降低術后局部復發(fā)率；同時對于低位直腸癌，術前放療可能通過提高保肛率來使患者的生活質(zhì)量得到提高[3-4]。目前局部晚期直腸癌的術前放療主要有長程放療(1.8～2.0 Gy×25次，5～5.5周完成)和短程放療(5 Gy×5次，1周完成)兩種模式[5]。兩種模式的主要區(qū)別為單次劑量的照射強度和照射次數(shù)，即前者為常規(guī)分割多分次照射，而后者為大分割少分次照射。

腫瘤生長依賴于腫瘤血管的生成[6]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)擁有維持血管內(nèi)皮細胞活性和誘導其增殖等多種功能，并在大多數(shù)癌細胞中過度表達，是腫瘤血管生成最重要的刺激因子[7-8]。缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor 1-alpha，HIF-1α)是VEGF的重要調(diào)控因子，HIF-1α/VEGF 軸是低氧激活腫瘤血管生成的主要機制[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，放射輻照同樣能誘導腫瘤細胞HIF-1α的表達，激活HIF-1α /VEGF 通路[11]，但目前關于不同劑量放射輻照對直腸癌腫瘤血管生成影響的研究較少。本研究在臨床樣本中發(fā)現(xiàn)，不同劑量分割模式的放療對直腸癌腫瘤血管生成的影響可能存在差異，并通過體外細胞實驗探討不同劑量分割放射治療對直腸癌血管生成的影響，以期為直腸癌放療方案的優(yōu)化提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例和組織標本 收集2017-2020年重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科經(jīng)病理確診為直腸癌的患者56例，其中男性32例，女性24例，年齡44～74(61.00±9.90) 歲?；颊呔M行術前新輔助放療，在放療結(jié)束后6～8周內(nèi)完成手術治療，且在術后由病理科進行病理的腫瘤退縮評級(tumor regression grade，TRG)。根據(jù)術前放療方案分為兩組：常規(guī)分割放療組(總劑量50 Gy，單次劑量2 Gy，共進行25次，每周5次，5周內(nèi)完成)42例，大分割放療組(總劑量為25 Gy，單次劑量5 Gy，共進行5次，1周內(nèi)完成)14例。根據(jù)AJCC腫瘤退縮分級(tumor regression grade, TRG)系統(tǒng)對放療效果進行分級：TRG0，無活的癌細胞殘留；TRG1，單個或小簇癌細胞殘留；TRG2，殘留癌灶，間質(zhì)纖維化；TRG3，僅少數(shù)或未見癌細胞消退。直腸腺癌組織樣本來源于2021年1-12月在重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科病理確診、并經(jīng)術前局部放療的直腸腺癌患者手術切除的腫瘤組織。其中術前行常規(guī)分割、大分割放射治療各5例，男性3例，女性2例，年齡47～71(55.79±9.22)歲。從同一患者手術切除的腫瘤組織中取2份樣本，一份多聚甲醛固定用于包埋切片，另一份超低溫冰箱保存。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批通過(2022-57)。

1.1.2 細胞、試劑與儀器 人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC由重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院分子腫瘤及表觀遺傳學重慶市重點實驗室提供；人直腸腺癌細胞SW1463購自美國ATCC公司。胎牛血清和1640培養(yǎng)基分別購自BI公司和Gibco公司；HIF-1α和VEGF的兔抗人多克隆抗體均購自博士德公司；β-actin的鼠抗人單克隆抗體購自碧云天公司；HRP標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗購自碧云天公司；PVDF膜、胰蛋白酶、RIPA裂解液和蛋白上樣緩沖液均購自碧云天公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE電泳配膠試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒、DAB顯色試劑盒、CCK-8試劑盒和ELISA試劑盒等購自碧云天公司。直線加速器購自VARIAN Medical Systems公司。

1.2 方法

1.2.1 組織標本處理及免疫組化 收集兩組患者的術后直腸腺癌組織，多聚甲醛固定、石蠟包埋后切片。用內(nèi)皮細胞標記物CD34抗體孵育，然后用DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒按說明書步驟對癌組織切片進行DAB染色。顯微鏡下觀察不同放療方案癌組織中的CD34陽性表達情況，拍照記錄，參照Weidner校正方法[12]計算微血管密度(microvessel density，MVD)。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 人直腸腺癌細胞株SW1463和人臍靜脈內(nèi)皮細胞株HUVEC在37 ℃、5% CO2的細胞孵箱環(huán)境中用1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)單獨培養(yǎng)。每2天進行細胞換液，當細胞處于生長對數(shù)期、融合度達80%左右可進行細胞傳代或凍存。傳代時用0.25%胰蛋白酶(含EDTA)在PBS清洗細胞后進行消化，凍存時采用無血清凍存液在-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存細胞。

1.2.3 不同劑量照射腫瘤細胞及條件培養(yǎng)基制備 采用放射線照射細胞以模擬體內(nèi)放療情況。將培養(yǎng)的SW1463細胞以5×107/皿接種于直徑10 cm的細胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2細胞孵箱中培養(yǎng)。當細胞融合度達70%時分成4組，根據(jù)前期實驗結(jié)果和文獻[13]，分別給予0、4、12、24 Gy單次放射線照射。以細胞培養(yǎng)皿表面為入射中心，SSD設置為100 cm，射野大小為10 cm×10 cm，輸出輻射能量為6 MV。細胞輻照結(jié)束后立即進行細胞換液，用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h。收集上述不同分組腫瘤細胞照射后培養(yǎng)基，1 000×g離心10 min。取離心后的上清并用0.45 μm無菌過濾器過濾即得到照射后條件培養(yǎng)基。

1.2.4 Western blot分別檢測HIF-1α和VEGF在組織和細胞中的表達 將收集的經(jīng)常規(guī)分割放射治療和經(jīng)大分割放射治療的直腸腺癌組織剪成合適大小，加入適量液氮冰凍后再加入100 μL裂解液長程研磨，再用勻漿器進一步研磨。研磨結(jié)束后移入1.5 mL EP管，用4 ℃離心機12 000 r/min離心10 min，離心后吸取上清移至新1.5 mL EP管得到組織總蛋白。

將不同劑量照射后的SW143細胞用PBS清洗3遍，每皿加入100 μL RIPA裂解液(含1%PMSF)后于搖床上反應25 min。用細胞刮刮取細胞，超聲裂解，4 ℃離心機12 000 r/min離心10 min，吸取離心后的上清移至1.5 mL EP管得到細胞總蛋白。

總蛋白提取后用BCA試劑盒按說明書測蛋白濃度，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后100 ℃加熱變性蛋白5 min。用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒按說明書配制濃縮膠和分離膠進行SDS-PAGE電泳(每孔蛋白上樣量為40 μg)，冰上250 mA轉(zhuǎn)膜，配制脫脂奶粉(5%濃度)封閉1 h，TBST清洗PVDF膜3×10 min后孵育一抗(稀釋比例1∶1 000)，4 ℃搖床過夜。次日同樣步驟清洗PVDF膜3×10 min，孵育二抗2 h(稀釋比例1∶3 000),再次清洗PVDF膜后用ECL試劑盒進行曝光顯影并保存結(jié)果。

1.2.5 ELISA檢測細胞上清液中HIF-1α和VEGF的濃度 收集不同劑量照射后的SW1463細胞培養(yǎng)基，離心后收集上清液，使用ELISA試劑盒檢測VEGF在各組細胞上清液中的濃度水平。

1.2.6 CCK-8檢測細胞增殖 將培養(yǎng)的SW1463細胞和HUVEC細胞以2 000/孔接種于96孔板中。待細胞貼壁后分成4組，分別給予0、4、12、24 Gy單次放射線輻照。照射后更換新鮮培養(yǎng)基，并于照射后的0、24、48、72 h加入10 μL/孔的CCK-8試劑。用酶標儀在避光孵育2 h后檢測波長為450 nm時的光密度值[D(450)]。

將培養(yǎng)的HUVEC細胞以2 000/孔接種于96孔板中，并分成4組，分別加入收集的SW1463細胞不同劑量(0、4、12、24 Gy)照射后條件培養(yǎng)基100 μL/孔。于接種后的0、24、48、72 h加入10 μL/孔的CCK-8試劑。用酶標儀在避光孵育2 h后檢測波長為450 nm時的光密度值[D(450)]。

1.2.7 克隆形成實驗 將HUVEC細胞以500/孔接種于6孔板中，加入收集的SW1463細胞照射后條件培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)7 d。當肉眼可觀察到細胞集落形成后終止培養(yǎng)，棄掉培養(yǎng)液，PBS清洗后加入4%多聚甲醛(1 mL/孔)固定30 min。結(jié)晶紫(1 mL/孔)染色15 min，PBS清洗、干燥后拍照，并計算克隆數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 腫瘤退縮評級情況

常規(guī)分割放療組42例患者術后病理標本中TRG0共8例，TRG1共7例，TRG2共11例，TRG3共16例；大分割放療組14例患者術后病理標本中TRG0共1例，TRG1共2例，TRG2共8例，TRG3共3例。經(jīng)χ2檢驗，兩組放療方案效果差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 不同分割放療組直腸癌患者病理TRG評級

2.2 免疫組化檢測直腸癌樣本內(nèi)CD34陽性表達并進行MVD計數(shù)

為了比較常規(guī)分割、大分割放射治療后直腸癌患者癌組織內(nèi)血管密度情況，采用DAB染色，血管內(nèi)皮細胞用CD34標記，血管內(nèi)皮細胞胞漿或胞膜呈現(xiàn)棕色或棕黃色染色顆粒為陽性表現(xiàn)。結(jié)果顯示，大分割放療組CD34陽性染色情況及MVD計數(shù)顯著高于常規(guī)分割放療組(P<0.05，圖1)。

A：免疫組化檢測常規(guī)分割放療組(左)、大分割放療組(右)術后直腸腺癌組織標本CD34陽性表達；B：兩組患者直腸癌組織MVD計數(shù)(n=5) 1： 常規(guī)分割放療組；2：大分割放療組；a：P<0.05，與常規(guī)分割放療組比較

2.3 Western blot檢測直腸癌組織中VEGF和HIF-1α蛋白的表達

為了檢測不同放射治療模式下直腸癌組織中促血管生成因子的表達情況，采用Western blot檢測直腸癌樣本中促血管生成相關蛋白VEGF和HIF-1α的表達，并用Image J軟件定量分析各蛋白條帶的灰度值(蛋白相對表達量=目的/內(nèi)參蛋白灰度值)。結(jié)果顯示，大分割放療組直腸癌組織中VEGF和HIF-1α蛋白表達水平顯著高于常規(guī)分割放療組(P<0.01，圖2)。

A：Western blot檢測結(jié)果 1： 常規(guī)分割放療組；2：大分割放療組；B：蛋白相對表達量 a：P<0.01，與常規(guī)分割放療組比較

2.4 CCK-8檢測直腸癌細胞和血管內(nèi)皮細胞的增殖情況

采用細胞實驗來模擬人體放療情況，并使用CCK-8檢測兩種細胞受不同劑量輻照后的增殖情況。結(jié)果顯示，72 h后SW1453細胞(P<0.05)和HUVEC細胞(P<0.05)的增殖能力均隨所受照射劑量的加大而降低，且4、12、24 Gy組均顯著低于0 Gy組(P<0.05，圖3)。

A：SW1453細胞；B：HUVEC細胞； a：P<0.05，與0 Gy比較

2.5 Western blot檢測直腸癌細胞中VEGF和HIF-1α表達

采用Western blot檢測放療后SW1463細胞中促血管生成因子的蛋白表達水平。結(jié)果顯示，未經(jīng)放射處理的SW1463細胞中VEGF和HIF-1α的蛋白表達水平較低，隨著所受放射劑量的加大，SW1463細胞中VEGF(P<0.01)和HIF-1α(P<0.01)蛋白的表達水平均逐漸提高，且4、12、24 Gy均顯著高于0 Gy(P<0.01，圖4)。

A：Western blot檢測結(jié)果；B：蛋白相對表達量 a：P<0.01，與0 Gy比較

2.6 ELISA檢測直腸癌細胞上清液中VEGF的濃度

為了檢測不同劑量射線照射后SW1463細胞促血管生成因子VEGF的分泌情況，收集SW1463細胞上清并采用ELISA檢測其中VEGF的蛋白濃度水平。結(jié)果顯示，SW1463細胞上清中VEGF含量與所受放射的劑量大小呈正相關，未經(jīng)放射處理的SW1463細胞上清中的VEGF含量較低，隨著放射劑量的增加，細胞上清中VEGF的含量逐漸升高，且4、12、24 Gy均顯著高于0 Gy(P<0.01，圖5)。

a：P<0.01，與0 Gy比較

2.7 CCK-8檢測血管內(nèi)皮細胞在條件培養(yǎng)基影響下的增殖情況

通過CCK-8實驗檢測HUVEC細胞在不同劑量輻照條件培養(yǎng)基干預下的增殖情況。結(jié)果顯示，與未放射條件培養(yǎng)基組相比，大劑量放射處理的直腸癌細胞培養(yǎng)基干預顯著提高了HUVEC細胞的增殖能力(P<0.01)，且4、12、24 Gy均顯著高于0 Gy(P<0.01)；隨條件培養(yǎng)基所受放射劑量的加大，其干預提高HUVEC細胞增殖能力的作用越明顯(P<0.01，圖6)。

a：P<0.01，與0 Gy輻照條件培養(yǎng)基比較

2.8 克隆形成實驗檢測細胞條件培養(yǎng)基對血管內(nèi)皮細胞增殖的影響

為了進一步驗證血管內(nèi)皮細胞在SW1463細胞輻照后條件培養(yǎng)基干預下的增殖情況， 采用克隆形成實驗并計數(shù)了各組條件培養(yǎng)基干預培養(yǎng)后HUVEC細胞形成克隆的情況。結(jié)果表明，大劑量輻照處理的直腸癌細胞培養(yǎng)基相比于未經(jīng)輻照的條件培養(yǎng)基，能顯著提高人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC的增殖能力(P<0.01)，且4、12、24 Gy均顯著高于0 Gy(P<0.01，圖7)。

A：分別為0、4、12、24 Gy條件培養(yǎng)基；B：克隆形成數(shù)計數(shù) a：P<0.01，與0 Gy條件培養(yǎng)基比較

3 討論

隨著人們生活水平的提升，隨之而來的是生活習慣和飲食結(jié)構的改變，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升態(tài)勢[14]。放射治療作為直腸癌治療的重要組成方式之一，其時機和劑量的把控顯得尤為關鍵。長久以來，臨床上采用先手術再放療來降低腫瘤復發(fā)率，延長患者生存期。但近年來研究表明，術前放療不僅具有傳統(tǒng)術后放療模式的優(yōu)點，還具有縮小瘤體體積、降低腫瘤分期、增加部分患者進行根治性切除手術的機會和提高保肛率等多種優(yōu)勢[15-16]。因此，直腸癌的術前放療得到了臨床醫(yī)師的廣泛認可和運用。

過去，研究者對直腸癌的術前放療模式進行了多種劑量組合的探索，包括長程的常規(guī)分割放療模式：每次劑量1.8～2.0 Gy，進行25～28次；短程的大分割放療模式：每次劑量5 Gy，進行5次；綜合的新型放療模式：每次劑量3 Gy，進行10次。遺憾的是，在局部復發(fā)、 遠處轉(zhuǎn)移和總生存率方面各放療模式并未發(fā)現(xiàn)顯著差異。但在患者依從性和醫(yī)療資源占用方面， 長程常規(guī)分割放療存在一定的劣勢，且一般認為長程常規(guī)分割放療后患者更易發(fā)生輻射毒副反應[5，17-18]。本研究通過術后病理TRG分級對常規(guī)分割放療模式和大分割放療模式進行比較，結(jié)果顯示兩種放療分割模式在術后病理的TRG分級上無顯著差異。但是本研究在不同劑量分割方式放療后的直腸癌患者術后樣本中發(fā)現(xiàn)，大分割放療組直腸癌組織內(nèi)CD34陽性染色和MVD計數(shù)均高于常規(guī)分割放療組，推測可能與短程放療采用的單次大劑量分割方式促進直腸癌組織內(nèi)腫瘤血管的生成有關。為此，本研究檢測了各組樣本中HIF-1α和VEGF的蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)大分割放療組直腸癌樣本中HIF-1α和VEGF蛋白的表達水平顯著高于常規(guī)分割放療組。于是在體外細胞實驗中，本研究使用不同放射劑量處理直腸癌細胞及血管內(nèi)皮細胞以模擬體內(nèi)情況。結(jié)果顯示，雖然大劑量的輻照直接降低了血管內(nèi)皮細胞和直腸癌細胞的增殖能力，但是通過檢測直腸癌細胞內(nèi)HIF-1α、VEGF的水平及上清液中VEGF的蛋白濃度，證明了射線輻照的確能促進這些因子在腫瘤細胞中的高表達。VEGF可直接作用于血管內(nèi)皮細胞，誘導其增殖并促進血管的構建，還能通過旁分泌途徑間接促進腫瘤的進展，是目前已發(fā)現(xiàn)的促腫瘤血管生成因子中作用效果最強的刺激因子[19-20]。而HIF-1α是VEGF表達的主要調(diào)控因子，能增強VEGF的轉(zhuǎn)錄活性和增加VEGF mRNA穩(wěn)定性。在缺氧或受輻照的條件下，腫瘤細胞通過增強HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)VEGF表達來促進腫瘤新生血管形成[11,21-22]。

為了證實VEGF對血管內(nèi)皮細胞的影響，實驗收集了照射后癌細胞的培養(yǎng)基以干預血管內(nèi)皮細胞，發(fā)現(xiàn)這些條件培養(yǎng)基的確能呈放射劑量依賴性地促進血管內(nèi)皮細胞的增殖。推測直腸細胞受到大劑量輻照后，細胞內(nèi)HIF-1α、VEGF的表達增加，釋放到胞外的VEGF蛋白也隨之增多，VEGF作為強力的促血管生成因子，可直接作用于血管內(nèi)皮細胞，促進血管內(nèi)皮細胞的增殖。

另外，在實驗中觀察到隨著放射劑量的增大，直腸癌細胞和血管內(nèi)皮細胞的增殖能力雖然逐漸下降，但下降率明顯放緩。推測這與細胞受到放射后DNA的損傷再修復有關，即小劑量照射后，細胞中亞致死性損傷的細胞占比例大。發(fā)生亞致死性損傷的細胞其DNA可在輻照停止后完成一定自我修復，從而逐漸恢復增殖能力。當輻照達到一定劑量時，大多數(shù)細胞將發(fā)生不可修復的致死性損傷。綜上，研究者推測大劑量的照射雖然直接降低了直腸癌細胞和血管內(nèi)皮細胞的增殖能力，但同時也促進了促血管生成因子HIF-1α、VEGF的表達升高，由于受到放射損傷的細胞存在再修復的機制，使得血管內(nèi)皮細胞在腫瘤中增殖的總體水平呈上升表現(xiàn)。

如今，放療技術水平的提升使大劑量照射得到進一步運用。由于增加了照射時的生物等效劑量，大劑量分割放療在多種腫瘤的治療中取得了良好的臨床效果[23]。研究表明，相比于常規(guī)分割照射，大劑量分割照射在聯(lián)合免疫治療方面有明顯的理論優(yōu)勢：大劑量分割照射后能產(chǎn)生更多的腫瘤抗原，且可誘導免疫細胞及時浸潤[24]。此外，大劑量分割照射還能通過促進樹突狀細胞成熟、細胞因子分泌及激活T 細胞特異性殺傷能力來加強免疫應答反應[25]。然而，腫瘤新生血管的增加會形成物理屏障，使免疫細胞到達腫瘤部位變得困難，限制免疫治療的有效性[10]。異常管脈系統(tǒng)還會形成缺氧和酸性微環(huán)境，使T淋巴細胞和自然殺傷細胞等抗腫瘤免疫細胞變成無反應狀態(tài)，隨后發(fā)生凋亡，加劇免疫抑制[26]。另一方面，VEGF除了刺激腫瘤血管生成，還作為趨化因子對免疫細胞產(chǎn)生不同程度影響[27-28]，如使樹突狀細胞和淋巴細胞等抗腫瘤免疫細胞相對缺乏，髓源性抑制細胞和腫瘤相關巨噬細胞等免疫抑制細胞積累，誘導免疫失衡。因此，如何優(yōu)化組合使大分割放療與免疫聯(lián)合達到最優(yōu)協(xié)同作用是值得進一步探索的問題。現(xiàn)在在肝癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤領域運用抗血管生成靶向藥物聯(lián)合免疫藥物的治療模式有了非常好的療效。在晚期結(jié)直腸癌領域，REGONIVO研究也證實了抗血管生成靶向藥物聯(lián)合免疫檢查點抑制劑的抗腫瘤效應[29]。在大劑量放療的同時應用抗血管生成的靶向藥物，而后與免疫治療聯(lián)合可能是本研究下一步的研究方向。

本研究仍存在局限，本研究雖然探討了不同劑量分割放射治療對直腸癌細胞增殖及血管生成的影響，但未進一步探討放射次數(shù)帶來的影響。此外，細胞實驗難以完全模擬臨床放療，研究者正在進行動物實驗進一步驗證研究結(jié)果。

綜上所述，本研究證實了單次大劑量的放射促進直腸癌細胞中HIF-1α和VEGF的表達，促進血管內(nèi)皮細胞的增殖，進而促進了腫瘤血管的生成，為探索腫瘤大劑量放療聯(lián)合免疫治療的優(yōu)化提供了一定參考。