俞穎琦，張旭含，胡奕然，王寒怡，孫 苗，周 婷

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121)

花草茶是一種以花卉植物的根、莖、葉、花為材料，經(jīng)過(guò)采收、干燥、加工后制成的沖泡式保健飲品.市場(chǎng)上常見(jiàn)的花草茶有茉莉花茶、玫瑰花茶、菊花茶、金銀花茶、檸檬茶和百合花茶等[1].茉莉花茶是花草茶中產(chǎn)量最多的品種，具有安神、潤(rùn)腸通便、理氣解郁等功效[1].玫瑰花茶是最受歡迎的花草茶之一，具有抗氧化、抗血栓、通經(jīng)絡(luò)、降血脂、助消化、美容養(yǎng)顏等作用[2-3].菊花茶是我國(guó)僅次于茶葉的第二大傳統(tǒng)飲品，具有散風(fēng)清熱、平肝明目、藥食兩用等功效[4].菊花品類眾多，本文重點(diǎn)選取貢菊為材料進(jìn)行研究.金銀花茶是近幾年流行的保健花草茶飲品，具有疏散風(fēng)熱、清熱解毒等作用[5-6].

長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)以上4種花草茶的研究主要集中在工藝參數(shù)對(duì)品質(zhì)的影響、加工過(guò)程中生化成分、香氣組分的變化規(guī)律等化學(xué)、藥理、臨床方面[4,6-7].本研究主要檢測(cè)某一廠家4種花草茶的總糖、總蛋白質(zhì)、總游離氨基酸、茶多酚、總黃酮、兒茶素類化合物質(zhì)量濃度，并分析它們與花草茶抗氧化活性的關(guān)聯(lián)性，以期為花草茶的生物活性評(píng)價(jià)提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣品為市場(chǎng)銷售的同一品牌——憶江南(杭州憶江南茶業(yè)有限公司)的4種花草茶制品，分別為玫瑰花茶、茉莉花茶、金銀花茶、貢菊花茶，樣品均為干制的整花，無(wú)茶葉摻雜.4種花草茶的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：貢菊花茶(10.5±0.1)%>金銀花茶(10.4±0.1)%>茉莉花茶(6.4±0.1)%>玫瑰花茶(6.2±0.6)%.

主要試劑：總糖檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，Bio-Rad蛋白質(zhì)測(cè)定染料濃縮物購(gòu)于伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司，牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，2%茚三酮溶液、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司，兒茶素類標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于北京華威銳科化工有限公司.除乙腈、甲酸和兒茶素類標(biāo)準(zhǔn)品為色譜純外，其余試劑均為分析純.

1.2 總糖質(zhì)量濃度的測(cè)定

樣品的總糖質(zhì)量濃度測(cè)定采取可見(jiàn)光分光光度法[8].根據(jù)總糖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，稱取磨碎的花草茶葉樣品0.1 g，加入1 mL 6 mol/L HCl溶液和1.5 mL蒸餾水，勻漿后沸水浴浸提0.5 h.加入1 mL 6 mol/L NaOH溶液，混勻后用蒸餾水定容至10 mL.8 500 r/min，離心半徑為6.5 cm，25 ℃條件下離心10 min，取上清液.上清液稀釋10倍加入150 μL DNS試劑混勻，沸水浴10 min后冷卻至室溫.最后加入900 μL蒸餾水混勻，540 nm下測(cè)定吸光值.另制備葡萄糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.樣品吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線后換算總糖質(zhì)量濃度.

1.3 總蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用改進(jìn)的Bio-Rad蛋白質(zhì)測(cè)定法進(jìn)行總蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定[9].稱取磨碎的花草茶樣品1 g，用沸水配制成1 mg/mL的樣品待測(cè)液.將蒸餾水與Bio-Rad蛋白質(zhì)測(cè)定染料濃縮物按4∶1比例稀釋.分別吸取1 mL Bio-Rad蛋白質(zhì)測(cè)定染料濃縮物稀釋液，加入2 μL樣品待測(cè)液、蒸餾水和1 μg/μL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品.搖勻后，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值.另制備牛血清蛋白系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.樣品吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線后換算總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度.

1.4 游離氨基酸總質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用茚三酮比色法測(cè)定游離氨基酸總質(zhì)量濃度[10].稱取磨碎的花草茶樣品3 g，加入450 mL蒸餾水，沸水浴45 min，每10 min晃動(dòng)一次.浸提結(jié)束后立即減壓過(guò)濾，用熱蒸餾水洗滌2～3次殘?jiān)?，將濾液轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶中，冷卻后定容.取1 mL上述濾液、0.5 mL pH8.0磷酸鹽緩沖液及0.5 mL 2%茚三酮溶液于25 mL比色管中，沸水浴15 min后，冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25 mL.靜置10 min后，在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.另制備谷氨酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.樣品吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線后換算游離氨基酸總質(zhì)量濃度.

1.5 茶多酚質(zhì)量濃度的測(cè)定

測(cè)定方法參考GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》[11].稱取磨碎的花草茶樣品0.2 g，加入5 mL 70%甲醇水溶液，置于70 ℃水浴中浸提10 min，中途攪拌一次.冷卻至室溫后，3 500 r/min，離心半徑為6.5 cm，離心10 min獲得提取液及殘?jiān)?用70%甲醇水溶液按上述步驟浸提殘?jiān)淮?，合并兩次提取液后?.45 μm膜過(guò)濾，取1 mL濾液定容至100 mL為樣品待測(cè)液.取樣品待測(cè)液1 mL，加入5 mL 10%福林酚試劑，于反應(yīng)的4～8 min內(nèi)加入4 mL 7.5% Na2CO3溶液，用蒸餾水定容并搖勻后于室溫靜置1 h，在765 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度.另制備沒(méi)食子酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.樣品吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線后換算茶多酚質(zhì)量濃度.

1.6 總黃酮質(zhì)量濃度的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[12]，稱取24.1 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和60%乙醇混合，用蒸餾水定容至50 mL，配制成482 μg/mL蘆丁溶液.參考上述茶多酚質(zhì)量濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)中的前處理方法進(jìn)行樣品前處理.取樣品待測(cè)液1 mL，加入0.3 mL 5% NaNO3溶液，混勻后靜置6 min，再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，混勻后靜置6 min，再加入4 mL 4% NaOH溶液，混勻后靜置15 min.用60%乙醇定容至10 mL，搖勻靜置，15 min后于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值.另制備蘆丁系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.樣品吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線后換算總黃酮質(zhì)量濃度.

1.7 兒茶素類化合物質(zhì)量濃度的測(cè)定

參考上述茶多酚質(zhì)量濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)中的前處理方法進(jìn)行樣品前處理.酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液配制參考文獻(xiàn)[12]：用甲醇將兒茶素(+C)、表兒茶素(EC)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)分別配制成質(zhì)量濃度梯度為10、50、100、250、500、1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

HPLC檢測(cè)條件參考文獻(xiàn)[13]：使用可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(VWD)，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；采用Waters XTerraRP18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱，設(shè)定色譜溫度為30℃；流動(dòng)相流速為1 mL/min；單次進(jìn)樣量為10 μL.選用的流動(dòng)相1為0.5%甲酸水溶液，流動(dòng)相2為乙腈.洗脫方式為梯度洗脫，在16 min內(nèi)流動(dòng)相2由6.5%線性增加至25%，到25 min時(shí)再回至初始狀態(tài)，平衡10 min.每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)的實(shí)驗(yàn).樣品吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線后，換算得到相應(yīng)兒茶素化合物的質(zhì)量濃度.

1.8 DPPH·清除法測(cè)定抗氧化活性

參考DPPH·清除法[14]，樣品前處理方法參考上述茶多酚質(zhì)量濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)中的前處理方法.4種花草茶的樣品待測(cè)液分別用甲醇稀釋10倍后，各取10 μL加入96孔酶標(biāo)板，分別加入200 μL 200 μmol/L DPPH·溶液，于暗處?kù)o置30 min后,517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值.樣品對(duì)照組用甲醇代替DPPH·溶液，空白對(duì)照組用甲醇代替樣品待測(cè)液.

樣品對(duì)DPPH·的清除率= l-[(A1-A2)/A0] ×100%，

式中,A1為樣品測(cè)試液吸光值；A2為樣品對(duì)照組吸光值；A0為空白對(duì)照組吸光值.

1.9 FRAP法測(cè)定抗氧化活性

參考文獻(xiàn)[15]，樣品前處理方法參考上述茶多酚質(zhì)量濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)中的前處理方法.將0.3 mol/L醋酸緩沖液(pH=3.6)、20 mmol/L的FeCl3溶液和10 mmol/L的TPTZ溶液按10∶1∶1體積比配制成FRAP工作液.取150 μL FRAP工作液、15 μL蒸餾水至96孔酶標(biāo)板，于暗處?kù)o置5 min.再各加入30 μL的4種花草茶樣品待測(cè)液，于暗處?kù)o置30 min后,595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值.樣品對(duì)照組用超純水代替FRAP工作液，空白對(duì)照組用甲醇代替樣品待測(cè)液.另制備FeSO4系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.樣品吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線后，換算FeSO4質(zhì)量濃度.

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析使用SPSS軟件，樣本間比較運(yùn)用鄧肯(Duncan)多重范圍檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 花草茶的總糖質(zhì)量濃度

由圖1可知，貢菊花茶總糖質(zhì)量濃度在4種樣品中最高，達(dá)到0.376 mg/mL；玫瑰花茶總糖質(zhì)量濃度最低(0.150 mg/mL)；金銀花茶(0.337 mg/mL)與茉莉花茶(0.332 mg/mL)的總糖質(zhì)量濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.125).

圖1 4種花草茶總糖質(zhì)量濃度Fig.1 Concentration of total sugar in four herbal teas

2.2 花草茶的總蛋白質(zhì)量濃度

4種花草茶的總蛋白質(zhì)量濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.064)，其中玫瑰花茶的總蛋白質(zhì)量濃度(0.286 mg/mL)略高于其他3種花草茶，見(jiàn)圖2.研究表明，可食用花中的蛋白質(zhì)含量豐富，菊花和玫瑰花中的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均超過(guò)10%[16].本研究中金銀花與茉莉花的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均超過(guò)10%.

2.3 花草茶的游離氨基酸總質(zhì)量濃度

4種花草茶中游離氨基酸總質(zhì)量濃度由高至低依次為玫瑰花茶(0.122 0 mg/mL)、貢菊花茶(0.096 0 mg/mL)、金銀花茶(0.069 6 mg/mL)和茉莉花茶(0.064 9 mg/mL)，見(jiàn)圖3.其中，金銀花茶與茉莉花茶的游離氨基酸總質(zhì)量濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.263).4種花草茶均含有一定量的游離氨基酸，但均低于文獻(xiàn)[16]報(bào)道的抹茶和綠茶等的游離氨基酸濃度，提示不同品種的茶葉游離氨基酸濃度差異較大.

2.4 花草茶的茶多酚質(zhì)量濃度

玫瑰花茶的茶多酚質(zhì)量濃度在4種花草茶中最高，達(dá)到35.9 mg/L；金銀花茶(6.61 mg/L)次之；茉莉花茶(2.84 mg/L)與貢菊花茶(2.29 mg/L)的茶多酚質(zhì)量濃度分別位列第三和第四，玫瑰花茶茶多酚質(zhì)量濃度遠(yuǎn)高于其余3種花草茶(圖4).茶多酚是茶葉或茶飲料中的天然抗氧化劑，4種花草茶中茶多酚質(zhì)量濃度不同主要與其加工方式有關(guān).花草茶屬于不發(fā)酵茶，部分花草茶通過(guò)殺青步驟使多酚氧化酶失活，因此茶多酚質(zhì)量濃度較高[16].

2.5 花草茶的總黃酮質(zhì)量濃度

由圖5可知，4種樣品中總黃酮最豐富的是玫瑰花茶(0.639 mg/L)，是其余3種的2倍以上；其次為金銀花茶和貢菊花茶，二者均為0.271 mg/L；茉莉花茶最低(0.245 mg/L)，茉莉花茶分別與金銀花茶、貢菊花茶的總黃酮質(zhì)量濃度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1).食用花中的黃酮類物質(zhì)種類各不相同，有蘆丁、槲皮素、芹菜素和山奈酚等.不同種類花草茶所含黃酮類物質(zhì)的種類、結(jié)構(gòu)及質(zhì)量濃度有差別[16].

2.6 花草茶的兒茶素類化合物質(zhì)量濃度

由表1可知，玫瑰花茶中的5種兒茶素類化合物質(zhì)量濃度均遠(yuǎn)超過(guò)其余3種花草茶(P<0.000 1)，只有在玫瑰花茶中檢測(cè)出表沒(méi)食子兒茶素(EGC).茉莉花茶的5種兒茶素類化合物總質(zhì)量濃度高于貢菊花茶，金銀花茶的最少.花草茶的品種、生長(zhǎng)環(huán)境、采摘條件以及加工方式等對(duì)兒茶素類化合物存在影響[13]，因此4種花草茶中兒茶素類組分構(gòu)成及質(zhì)量濃度不同.

表1 4種花草茶兒茶素類化合物質(zhì)量濃度Tab.1 Concentration of catechins in four herbal teas

2.7 花草茶的抗氧化活性

由圖6可知，4種花草茶中，玫瑰花茶對(duì)DPPH·的清除率遠(yuǎn)高于其余3種，達(dá)到18.4%，貢菊花茶的清除率極低，僅0.60%，金銀花茶和茉莉花茶則分別為4.87%、4.96%.在FRAP法檢測(cè)中，玫瑰花茶的抗氧化活性最強(qiáng)(11.1 mmoL/L)，金銀花茶(7.19 mmoL/L)、茉莉花茶(5.92 mmoL/L)、貢菊花茶(5.50 mmoL/L)的抗氧化活性依次降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1).4種花草茶的抗氧化能力強(qiáng)弱排序?yàn)槊倒寤ú?金銀花茶>茉莉花茶>貢菊花茶.

圖6 4種花草茶DPPH·清除率和FRAP法抗氧化活性

2.8 花草茶的抗氧化活性與其主要品質(zhì)化學(xué)成分間的相關(guān)性分析

分析4種花草茶中主要品質(zhì)化學(xué)成分含量與其抗氧化活性之間的相關(guān)性，結(jié)果表明，茉莉花茶中EGCG質(zhì)量濃度與FRAP值呈正相關(guān)(r=0.998，P<0.05)，貢菊花茶中+C以及總糖質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除能力均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.997，-0.998；P<0.05)，提示不同種類花草茶中發(fā)揮抗氧化活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)不完全相同，后續(xù)需要增大實(shí)驗(yàn)樣本量，進(jìn)一步分析并確定4種花草茶中發(fā)揮抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ).

3 討論

本研究主要測(cè)定比較了4種花草茶的總糖、總蛋白質(zhì)、總游離氨基酸、茶多酚、總黃酮、兒茶素類化合物的質(zhì)量濃度，并分析與花草茶抗氧化活性的關(guān)聯(lián)性.結(jié)果顯示，總糖質(zhì)量濃度：貢菊花茶>金銀花茶≈茉莉花茶>玫瑰花茶；總蛋白質(zhì)量濃度：玫瑰花茶≈金銀花茶>茉莉花茶>貢菊花茶；游離氨基酸總質(zhì)量濃度：玫瑰花茶>貢菊花茶>金銀花茶≈茉莉花茶；茶多酚質(zhì)量濃度：玫瑰花茶>金銀花茶>茉莉花茶>貢菊花茶；總黃酮質(zhì)量濃度：玫瑰花茶>金銀花茶=貢菊花茶>茉莉花茶；兒茶素類化合物總質(zhì)量濃度：玫瑰花茶>茉莉花茶>貢菊花茶>金銀花茶；抗氧化活性：玫瑰花茶>金銀花茶>茉莉花茶>貢菊花茶.

相關(guān)研究表明,茶多酚質(zhì)量濃度可能和抗氧化活性存在一定相關(guān)性[17-20].Park等[21]研究玫瑰花提取物抗氧化能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，多種多酚具有良好抗氧化作用，能達(dá)到有效清除DPPH·的效果；Qin等[22]在玫瑰茶泡液的20種成分中鑒定并驗(yàn)證了丁香酚為抗氧化成分；陳金娥等[23]在綠茶、紅茶和烏龍茶活性成分的抗氧化性研究中發(fā)現(xiàn)，茶多酚質(zhì)量濃度與抗氧化活性之間有顯著相關(guān)，并可能呈一定的量效關(guān)系.本研究發(fā)現(xiàn)，茉莉花茶中EGCG質(zhì)量濃度、貢菊花茶中+C以及總糖質(zhì)量濃度分別與其抗氧化活性之間顯著相關(guān).不同種類花草茶中發(fā)揮抗氧化活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)有待進(jìn)一步確證.

兒茶素類化合物屬于黃酮類成分，黃酮類成分是玫瑰花中發(fā)揮抗氧化功能的重要活性物質(zhì)之一[2].茶葉中的兒茶素類主要包括+C、EC、ECG、EGC、EGCG等[23].楊虎等[24]研究了玫瑰內(nèi)黃酮清除DPPH·的情況，結(jié)果顯示其清除DPPH·的能力略小于VC，與VE相近，說(shuō)明玫瑰花茶的強(qiáng)抗氧化能力與其總黃酮質(zhì)量濃度有一定聯(lián)系.本研究結(jié)果顯示，在兒茶素類化合物成分中，茉莉花茶EGCG質(zhì)量濃度與FRAP值呈顯著正相關(guān)，貢菊花茶+C質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除能力呈顯著負(fù)相關(guān).成品茶的抗氧化能力不同，可能是由于兒茶素濃度的差異[25].玫瑰花茶抗氧化活性遠(yuǎn)大于其余3種花草茶可能是因?yàn)槠渌瑑翰杷仡惢衔锍煞直壤煌瑢?dǎo)致的結(jié)果.不同種類花草茶的兒茶素類組成存在差異，對(duì)抗氧化活性的影響也會(huì)不同.

花草茶的總體抗氧化能力是其內(nèi)部各種物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果.茶葉中的多酚類物質(zhì)除去兒茶素類之外，還有山奈酚、槲皮素等，并且其中還存在茶多糖、茶氨酸等物質(zhì)，也會(huì)影響其抗氧化能力[26].茶多酚的主要成分之間可能存在一定的相互作用，會(huì)加強(qiáng)或抑制花草茶的總體抗氧化活性，但其具體的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究.此外，盡管本實(shí)驗(yàn)使用了DPPH·清除法和FRAP法測(cè)定花草茶對(duì)體外自由基的清除率，但仍無(wú)法與真實(shí)生物體內(nèi)的各種生物酶和活性氧自由基的反應(yīng)作用完全一致.