李文鑫，張子函，陳中陽，林益镕，王玉龍，陳大為，張森△

1 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院結直腸肛門外科 廣西南寧 530021

2 廣西消化道腫瘤加速康復外科基礎研究重點實驗室 廣西南寧 530021

3 創(chuàng)模生物科技（北京）有限公司 北京 102200

盡管隨著臨床診療技術的發(fā)展，結直腸癌患者的5年生存率有所提高，但總體治療效果仍有待進一步改善。其中，腫瘤異質性是值得關注的影響治療預后的因素[1]。因此，開展腫瘤特異性敏感藥物的相關研究應能給臨床治療帶來獲益。不同患者對藥物的敏感性不同，若要篩選出能使患者個體受益更大化的藥物，需要獲得患者的“個體化信息”，由此認為，建立腫瘤模型可有助于解決該問題。

近年來，人源腫瘤異種移植（patient-derived xenografts，PDX）模型受到了學者們的關注[2-3]。建立PDX模型需要直接將患者的腫瘤組織移植至免疫缺陷小鼠體內[4]，除腫瘤組織結構和細胞形態(tài)外，PDX模型還保留了腫瘤的分子生物學和遺傳學特征[5-7]，能夠更加準確地反映腫瘤的病理狀態(tài)及其微環(huán)境，有助于為臨床治療提供更為個體化的治療依據[8]。此外，PDX模型也可為抗癌藥物的研究提供一定的實驗基礎[9]。但是，基于現有的文獻報道，PDX模型的建模成功率較低，其中結直腸癌PDX模型的建模成功率為30%～63.5%[10-12]。影響PDX模型建模結果的因素有多種，包括患者臨床病理因素、移植動物種類和移植部位等[11]。在本研究中，我們重點探討影響結直腸癌PDX模型建模結果的患者臨床病理因素，以期為后續(xù)研究的開展提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

腫瘤組織標本來自廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院結直腸肛門外科2021年4月至2021年8月所收治的119例手術患者。納入患者為初診患者，并非多原發(fā)癌，術前未接受新輔助放化療，臨床病理資料完整。本研究經廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準（2022-KY-E-028）。

1.2 實驗動物

實驗動物選用6～8周齡NPSG小鼠，體重18～20g，購買自上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司（批號0013889、0014255、0014986），飼養(yǎng)于創(chuàng)模生物科技（北京）有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境相對濕度約為50%，溫度控制在20～26℃，給予充足飼料和飲水，12 h/12 h固定燈光周期。動物實驗方案通過創(chuàng)模生物IACUC委員會審批（IM-PDX-WGYL-20210101）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本處理 結直腸癌腫瘤組織標本離體30min內用組織保存液置于4℃保存，首先觀察標本大小，并明確標本是否完全浸沒在保存液中，標本溫度是否為2～8℃，保存液是否有異味、滲漏或污染。將腫瘤組織標本倒入一次性平皿，用鑷子將腫瘤組織標本轉移至磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，用手術刀切割成直徑1 mm的細條或直徑不超過1 mm的小塊。保留綠豆大小標本用于短片段重復序列（short tandem repeat，STR）檢測質控后，將腫瘤組織標本轉移至15 mL離心管中，加入5 mL消化酶。根據標本情況，于4℃條件下放置合宜時長。用一次性巴氏吸管吹打3～5 min，若瘤塊堵住吸管口，可將吸管在離心管底部戳動幾下。吹打至消化液混濁，可吸出10 μL消化液簡單計數，預估細胞量，并觀察細胞是否成團，成團應繼續(xù)吹打。若已經分散為單細胞，加入5 mL PBS稀釋后繼續(xù)吹打10次，靜置1 min待剩余殘渣沉降至管底，吸取上清過篩。用100 μM細胞過濾器過濾細胞，過濾后再用10～20 mL PBS清洗細胞過濾器，在4℃、300 g條件下離心10 min后收集細胞，小心吸取底部沉淀或倒掉上清。吸取的腫瘤細胞直接加入5倍體積的1×紅細胞裂解液，于室溫放置5 min后在4℃、300 g條件下離心5 min后收集細胞。

1.3.2 腫瘤移植 將腫瘤組織標本消化成單細胞后，在單細胞懸液中添加血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、ROCK-1抑制劑、胰島素及氫化可的松，并按1:1比例添加Matrigel，接種于NPSG小鼠側肩部皮下。待腫瘤生長至800～1 000 mm3，采用過量二氧化碳吸入方式處死小鼠，收集腫瘤，建立PDX模型種子庫P0代，保存于-80℃超低溫冰箱。收取少量速凍標本，用于基因組學分析、STR質控及病原微生物檢測。將標本消化為單細胞，用于體內實驗P1代接種。

1.3.3 腫瘤移植成功與失敗的判斷標準 腫瘤移植成功與失敗的判斷標準參照參考文獻[5]與參考文獻[13]制定。成功標準：腫瘤移植后小鼠成瘤，且小鼠腫瘤能正常傳代。失敗標準：小鼠接種成瘤后小鼠死亡、腫瘤回縮，或接種5個月后未成瘤。

1.4 患者臨床病理資料收集

收集患者年齡，性別，合并慢性病（如高血壓病、糖尿病、心血管疾?。?，腫瘤部位，腫瘤占據腸腔周徑，腫瘤最大徑，術前CEA，術前CA199，術前CA125，術前其他器官轉移（根據術前胸腹盆CT檢查結果判斷），腫瘤大體分型，腫瘤組織學分類，腸壁浸潤程度，淋巴結轉移，神經侵犯，脈管侵犯，腫瘤Ki-67等指標信息。其中，Ki-67分級參照參考文獻[13]，根據二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）免疫染色結果定義等級：“N”為陰性，＞0～25%為（+），＞25%～50%為（++），＞50%～75%為（+++），＞75%為（++++）。

1.5 研究分組

在剔除PDX模型建模結果的非正常數據后，根據建模結果分為兩組（成功組或失敗組），再分別對相應的結腸癌患者及直腸癌患者臨床病理資料進行分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行數據分析。計數資料用（n）表示，兩組間比較采用χ2檢驗、校正χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 納入患者情況及PDX模型建模結果總體情況

共納入結腸癌患者81例，直腸癌患者38例。有44例PDX模型建模成功，其中結腸癌31例、直腸癌13例，中位建模成功時間為47.5（24.5，83.0）d。各建模成功模型小鼠的成瘤時間見表1。建模成功的模型小鼠荷瘤情況、腫瘤外觀及腫瘤鏡下病理如圖1、圖2。

表1 44例建模成功模型小鼠的成瘤時間d

2.2 兩組對應的結腸癌患者臨床病理資料比較

兩組對應的結腸癌患者腫瘤最大徑和術前是否存在其他器官轉移情況比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；兩組對應的結腸癌患者年齡、性別、合并慢性病情況、腫瘤部位、腫瘤占據腸腔周徑、術前CEA水平、術前CA199水平、術前CA125水平、腫瘤大體分型、腫瘤組織學分類、腸壁浸潤程度、淋巴結轉移情況、神經侵犯情況、脈管侵犯情況、腫瘤Ki-67表達情況比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表2。

表2 兩組對應的結腸癌患者臨床病理資料比較n

表2（續(xù)）

表2（續(xù)）

2.3 兩組對應的直腸癌患者臨床病理資料比較

兩組對應的直腸癌患者神經侵犯情況和術前是否存在其他器官轉移情況比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；兩組對應的直腸癌患者年齡、性別、合并慢性病情況、腫瘤占據腸腔周徑、腫瘤最大徑、術前CEA水平、術前CA199水平、術前CA125水平、腫瘤大體分型、腫瘤組織學分類、腸壁浸潤程度、淋巴結轉移情況、脈管侵犯情況、Ki-67表達情況比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表3。

表3 兩組對應的直腸癌患者臨床病理資料比較n

表3（續(xù)）

3 討論

PDX模型是將腫瘤患者的腫瘤組織移植至免疫缺陷小鼠體內，并使腫瘤組織在小鼠體內生長的一種腫瘤模型。PDX模型最重要的方面是保留患者腫瘤的分子生物學和遺傳學特征，可以構成保留患者原始腫瘤特征的臨床前模型，用于研究腫瘤進展、腫瘤治療和腫瘤耐藥的機制[14]。與基于腫瘤細胞株的異種移植相比，雖然PDX模型的移植成功率較低，但該技術使得動物模型腫瘤更加接近患者腫瘤，能更好地反映患者的腫瘤信息[15]。

目前，PDX模型已應用于多種腫瘤的研究當中，包括肝癌[15]、肺癌[16]、乳腺癌[17]、胃癌[18]、胰腺癌[19]等，可為抗腫瘤藥物的選擇提供參考，為探索腫瘤生物標志物及治療靶標提供實驗基礎，在結直腸癌領域也已有相關的研究報道。Nunes等[20]對52例結直腸癌PDX模型進行了分析，結果顯示這些模型動物對西妥昔單抗的治療反應與臨床患者用藥的反應相似。Yao等[21]在對79例結直腸癌PDX模型的研究中發(fā)現，同時抑制EGFR和RAF對存在KRAS或BRAF突變的PDX模型具有協(xié)同抗腫瘤活性，為存在KRAS或BRAF突變的結直腸癌患者的臨床治療提供參考依據。生物標志物和治療靶標探索是PDX模型的另外一個應用方向，它可以幫助我們更加深入地了解腫瘤的耐藥機制[22]。Bertotti等[7]在一項85例結直腸癌PDX模型研究中發(fā)現，HER2特異性擴增與KRAS野生型腫瘤的西妥昔單抗耐藥有關，這對于制定個體化的腫瘤治療策略具有一定的指導意義。

雖然PDX模型有諸多的優(yōu)點，但其較高的費用和較低的成功率不利于它的普及。因此，如何提高PDX模型的建模成功率成為一個令人關注的研究方向。PDX模型的建模成功率受多種因素的影響。腫瘤類型是其中一個重要的影響因素。不同類型的腫瘤移植成功率不盡相同，結腸癌、胰腺癌、膽道癌等是PDX模型建模成功率較高的腫瘤，而乳腺癌、胃癌、肝癌等的建模成功率較低[23]。而在模型動物方面，不同的動物類型也可能影響建模成功率，比如免疫缺陷的嚴重程度[24]。此外，移植部位對PDX模型建模成功率也有影響，研究表明皮下移植成瘤率較高[12,14,25]。

在本研究中，我們探討影響PDX模型建模結果的結直腸癌患者臨床病理因素。119例接受手術治療的結直腸癌患者的腫瘤組織標本進行PDX模型建模后，共有44例取得成功（成功率為37.0%）。結腸癌PDX模型成功建模31例（成功率為38.3%），直腸癌PDX模型成功建模13例（成功率為34.2%），高于Fujii等[11]的建模成功率（約30.0%），但與Oh等[26]的建模成功率（62.2%）存在一定差距。總的來說，我們的總體建模成功率符合預期。隨后，我們按照不同的腫瘤類型對患者的臨床病理資料分別進行分析，結果提示結腸癌患者的腫瘤最大徑及術前是否存在其他器官轉移情況與PDX模型建模結果有關，而直腸癌患者的神經侵犯情況及術前是否存在其他器官轉移情況與PDX模型建模結果有關。Na等[27]報道，腫瘤最大徑是腫瘤移植成功與否的獨立影響因素，本研究結果與之相符。但在Choi等[14]的研究中，研究者發(fā)現腫瘤大小、是否伴有神經侵犯與PDX模型建模成功率無關。不同研究的結論存在差異可能與納入研究的腫瘤類型不同有關。Ki-67反映腫瘤細胞的增殖能力，在Na等[27]的研究中發(fā)現Ki-67指數高的腫瘤能獲得相對更高的移植成功率，另外，Julien等[10]報道術前CEA水平也可能影響PDX模型建模成功率，但在本研究中未觀察到類似的結果。本研究發(fā)現術前是否存在其他器官轉移與PDX模型建模結果有關。類似的，在Oh等[26]的研究中，腫瘤分期晚、腫瘤分化程度低的患者腫瘤移植成功率相對較高，而這也可能是該研究PDX模型建模成功率較高的原因。

本研究存在一定局限性：（1）實驗過程中，我們通過保存液和低溫保存方法盡量保證了腫瘤組織標本從離體至進入實驗階段的腫瘤細胞活性，但不能除外因部分標本自離體至進入實驗室管理的時間把控問題，導致這些標本的腫瘤細胞活性較低，從而影響PDX模型建模成功率。（2）由不同研究人員進行取材操作及其取材效果也可能對研究結果有影響。后續(xù)，我們擬圍繞相關問題進行討論與改進，以進一步減少人為因素對研究結果的干擾。

基于本研究認為，術前是否存在其他器官轉移與結直腸癌PDX模型建模結果有關。此外，腫瘤最大徑、神經侵犯情況分別與結腸癌PDX模型、直腸癌PDX模型建模結果有關。影響PDX模型建模成功率的其他臨床病理因素還需進行更多的研究探討。

利益沖突聲明全體作者均聲明不存在與本文相關的利益沖突。