馮美琴，張譯文，孫 健,*

（1.金陵科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 南京 210038；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095）

干發(fā)酵香腸是一種傳統(tǒng)的肉制品，因風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)價(jià)值高及貯存時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)備受歡迎，但其生產(chǎn)周期長、成品質(zhì)量不穩(wěn)定和潛在的安全隱患等問題亟待關(guān)注。發(fā)酵劑的出現(xiàn)解決了上述問題。其中，最常用的是乳酸菌和凝固酶陰性葡萄球菌。乳酸菌可以快速降低pH值，促進(jìn)亞硝酸鹽的分解并抑制病原體的生長，而葡萄球菌賦予產(chǎn)品良好的色澤。它們還在蛋白質(zhì)降解成小肽和氨基酸的過程中發(fā)揮重要作用，從而改善產(chǎn)品風(fēng)味和提高營養(yǎng)價(jià)值。肽的形成不僅促進(jìn)肉類風(fēng)味的形成，其本身還具有多種生物活性，其中抗氧化活性備受研究者關(guān)注?？寡趸目赡芡ㄟ^阻斷自由基鏈反應(yīng)抑制自由基活性，合成抗氧化劑由于具有強(qiáng)烈副作用包括肝損傷和致癌性而受到消費(fèi)者的抵制和質(zhì)疑，所以目前開發(fā)高效、安全、無毒的天然抗氧化肽已經(jīng)成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。

目前已有多項(xiàng)研究探究了發(fā)酵劑對發(fā)酵產(chǎn)物中多肽的抗氧化活性的影響。植物乳桿菌與釀酒酵母共發(fā)酵會(huì)顯著增加薏仁米發(fā)酵液的體外抗氧化活性。相比于未接種的香腸，Mejri等也從接種乳酸菌和葡萄球菌的香腸中提取出更多具有更高的抗氧化和降血壓活性的多肽。課題組前人報(bào)道發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌CD10和模仿葡萄球菌NJ201兩種菌接種肌原纖維蛋白和肌漿蛋白能有效促進(jìn)蛋白降解，并且增強(qiáng)多肽，特別是小分子多肽的抗氧化能力。但是混合發(fā)酵劑應(yīng)用于香腸實(shí)際體系后對多肽及其生物活性的影響仍缺乏深入研究。而且目前關(guān)于肉類尤其是發(fā)酵香腸抗氧化肽的研究主要停留在化學(xué)反應(yīng)等體外層面，體內(nèi)活性研究鮮有報(bào)道。由于人體消化環(huán)境非常復(fù)雜，抗氧化肽的實(shí)際效果僅憑體外實(shí)驗(yàn)無法確切衡量。因此本研究結(jié)合體外抗氧化反應(yīng)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，全面衡量接種植物乳桿菌CD101和模仿葡萄球菌NJ201發(fā)酵香腸的多肽體內(nèi)外抗氧化作用，旨在為發(fā)酵香腸的深入應(yīng)用提供更多理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌CD101（CD101，NCBI編號(hào)MG798695）；模仿葡萄球菌NJ201（NJ201，NCBI編號(hào)MG798688）。

1.1.2 原料與試劑

豬后腿精肉、豬背膘、豬腸衣 江蘇省蘇食肉品有限公司南京分公司；鹽、蔗糖、姜粉、五香粉、白胡椒粉 江蘇省南京市蘇果超市。

葡萄糖 南通奧凱生物技術(shù)開發(fā)有限公司；亞硝酸鈉 杭州龍山化工有限公司；異抗壞血酸鈉 鄭州拓洋實(shí)業(yè)有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒、總蛋白試劑盒南京建成生物工程研究所。其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

OptiMair垂直流超凈工作臺(tái) 新加坡藝思高科技有限公司；HVE-50自動(dòng)高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；WH-2微型渦旋混合儀 上海滬西分析儀廠有限公司；螺旋接種儀、自動(dòng)影像分析菌落計(jì)數(shù)儀 法國Interscience公司；ICP260生化培養(yǎng)箱 德國Memmert公司；GM200刀式研磨儀 德國Retsch公司；T25勻漿機(jī)德國IKA公司；TC 12E絞肉機(jī) 意大利Sirman公司；VF608灌腸機(jī) 德國Handtmann公司；KBF 720恒溫恒濕箱 德國Binder公司；Avanti J-E高速冷凍離心機(jī)美國Beckman Coulter公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；HH-42水浴鍋 常州國華電器有限公司；ES2030冷凍干燥機(jī) 日本Hitachi公司；Spectral Max M2e多功能酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；PTF-A300型萬分之一電子天平 瑞士Precisa公司；SIM-F124制冰機(jī) 日本三洋電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵劑的活化與制備

于恒溫37 ℃的條件在MRS（de Man，Rogosa and Sharpe）液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)植物乳桿菌CD101 20 h，于恒溫30 ℃在甘露醇鹽瓊脂（mannitol salt agar，MSA）液體培養(yǎng)基培養(yǎng)模仿葡萄球菌NJ201 20 h；活化兩次，吸取所需體積的菌液12 000×、4 ℃離心5 min，舍棄上清液，然后用無菌生理鹽水反復(fù)洗滌沉淀數(shù)次。

1.3.2 干發(fā)酵香腸的制作

參考曹辰辰等的方法。新鮮豬后腿肉與豬背膘質(zhì)量比為8∶2，其他成分以肉質(zhì)量為基礎(chǔ)添加：食鹽2%、蔗糖1%、葡萄糖1%、亞硝酸鈉0.015%、異抗壞血酸鈉0.05%、姜粉0.1%、白胡椒粉0.1%、五香粉0.1%。接種組發(fā)酵劑配比為植物乳桿菌CD101∶模仿葡萄球菌NJ201＝1∶1，接種量為10CFU/g。工藝流程：原料肉→漂洗→絞肉→攪拌（發(fā)酵劑）→灌腸→恒溫發(fā)酵→干燥成熟。

按照8∶2比例將瘦肉和肥肉混合均勻并加入所需的調(diào)味料。以不添加任何發(fā)酵劑的自然發(fā)酵香腸為對照組；以接種發(fā)酵劑的香腸為接種組。在恒溫恒濕箱中以30 ℃、相對濕度80%的條件發(fā)酵24 h，然后在15 ℃、相對濕度75%的條件下干燥3 d，最后以12 ℃、相對濕度72%條件成熟17 d得到發(fā)酵香腸樣品。

1.3.3 發(fā)酵香腸中多肽提取及含量測定

發(fā)酵香腸（21 d）中多肽提取及含量測定參考Xing Lujuan等方法，略修改。不同階段的自然發(fā)酵和接種發(fā)酵香腸按固定25 g原始鮮瘦肉質(zhì)量所得到的香腸提取多肽。樣品加入100 mL pH 7.2 磷酸鹽緩沖溶液，冰浴勻漿3 次（18 000×，10 s×3），4 ℃靜置2 h后12 000×、4 ℃離心20 min。取上清液，經(jīng)紗布過濾后加入3 倍體積40%乙醇溶液，靜置過夜（12 h）。之后繼續(xù)12 000×、4 ℃離心20 min，上清液經(jīng)0.45 μm水系濾膜抽濾。濾液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮去除乙醇，剩余肽液凍干，得到粗肽粉，于-20 ℃密封保存。多肽含量的測定首先需要配制鄰苯二甲醛混合試劑，80 mg鄰苯二甲醛溶于2 mL甲醇中，依次加入50 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉溶液、5 mL 20%十二烷基硫酸鈉和200 μL-巰基乙醇后，用純水定容到100 mL。此試劑現(xiàn)用現(xiàn)配。取100 μL的上述肽液與2.0 mL鄰苯二甲醛試劑混合，室溫反應(yīng)2 min。隨后在340 nm波長處測定吸光度。以胰酪蛋白胨作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算發(fā)酵香腸粗肽液中的多肽含量。

1.3.4 體外抗氧化活性

1.3.4.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力的測定

參照Shimada等的方法，略修改。配制質(zhì)量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的肽液，并以谷胱甘肽（glutathione，GSH）為陽性對照組。將0.5 mL肽液加入0.5 mL以95%乙醇溶液溶解的0.2 mmol/L DPPH自由基溶液，混勻，于室溫放置30 min后，測定混合物在517 nm波長處的吸光度，95%乙醇溶液替換DPPH自由基溶液為空白組，95%乙醇溶液替換肽液為對照組。肽液對DPPH自由基的清除能力計(jì)算如式（1）所示：

1.3.4.2 金屬離子螯合能力的測定

參考Oh等方法。分別取1 mL質(zhì)量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的肽液與0.05 mL 2 mmol/L FeCl溶液合并。然后將0.2 mL 5 mmol/L Ferrozine試劑加入反應(yīng)混合物中并充分混合。反應(yīng)混合物在室溫下反應(yīng)10 min。在562 nm波長處測定吸光度，并以GSH為陽性對照組。去離子水代替樣品為對照組。肽液金屬離子螯合能力計(jì)算如式（2）所示：

1.3.4.3 羥自由基清除能力的測定

采用鄰二氮菲法。以GSH為對照組。0.6 mL 5 mmol/L鄰二氮菲溶液中加入0.4 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L、pH 7.4）混勻，加入0.6 mL粗肽溶液及0.6 mL EDTA（15 mmol/L），混勻后加入0.6 mL FeSO溶液（5 mmol/L），混勻后加入0.8 mL 0.1% HO溶液，渦旋混勻后于37 ℃靜置1 h，測定樣品在536 nm波長處的吸光度；超純水替換樣品測得的吸光度；超純水代替HO測得吸光度。計(jì)算公式如下：

1.3.4.4 2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除能力的測定

按照ABTS試劑盒步驟測定。參考Zaky等的方法。等體積ABTS溶液和氧化劑配制ABTS工作液，黑暗中反應(yīng)14 h。用磷酸緩沖溶液稀釋工作液45 倍后，取200 μL溶液與10 μL樣品混合，室溫反應(yīng)4 min，然后在734 nm波長處測定吸光度。以超純水代替肽液作為對照組；Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品（0.15～1.5 μmol/L）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品對ABTS陽離子自由基的清除情況，單位為mol/L（Trolox當(dāng)量計(jì)）。以GSH為陽性對照。

1.3.5 體內(nèi)抗氧化活性

1.3.5.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和分組

選用健康ICR小鼠共60 只，雌雄各半，SPF級(jí)，質(zhì)量18～22 g，來源于上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。飼養(yǎng)條件：保持室溫（22±2）℃和中等相對濕度（50±10）%的條件，小鼠采用同室分籠飼養(yǎng)，每籠4 只，可以自由進(jìn)食和飲水，噪音小于60 dB，明暗間隔12 h為一循環(huán)，以國家標(biāo)準(zhǔn)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，然后將60 只小鼠隨機(jī)按照性別分為5 組，每組各12 只（雄性/雌性）。采用皮下注射100 mg/（kg·d）-半乳糖構(gòu)建小鼠氧化模型。給藥28 d，最后一次給藥后將小鼠禁食12 h。正常對照組小鼠皮下注射和灌胃等量生理鹽水；氧化模型組灌胃等量生理鹽水；VC對照組灌胃5 mg/（kg·d）的VC；低質(zhì)量濃度多肽添加組（低肽組）灌胃40 mg/（kg·d）的粗肽液；高質(zhì)量濃度多肽添加組（高肽組）灌胃100 mg/（kg·d）的粗肽液。

1.3.5.2 生長性能的檢測

最后一次給藥12 h后，將小鼠稱質(zhì)量，處死并進(jìn)行解剖；采集小鼠的腎臟、胰臟、心臟、脾臟等臟器，以4 ℃生理鹽水漂洗并用濾紙吸干，稱質(zhì)量。臟器指數(shù)計(jì)算如式（4）所示：

1.3.5.3 血樣和組織樣的制備與檢測

小鼠飼養(yǎng)28 d后，眼眶取血后處死小鼠并進(jìn)行解剖，3 000×、25 ℃離心10min取上清液，測定SOD、GSH-PX、CAT活性及總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）。肝臟組織取出后立刻放于-80 ℃液氮罐進(jìn)行急凍，測定肝臟SOD、GSH-PX、CAT活性及MDA含量。各指標(biāo)的測定步驟參考南京建成生物工程研究所試劑盒說明書。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)每個(gè)處理組設(shè)置6 個(gè)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)使用SAS V8軟件中的Duncan’s Multiple-Range Test和單因素方差分析，結(jié)果以 ±表示，均用Origin 2020作圖。＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

如圖1A所示，在1～5 mg/mL范圍內(nèi)，接種發(fā)酵香腸粗肽液清除DPPH自由基的能力顯著高于對照組（＜0.05），都呈劑量依賴型。隨著質(zhì)量濃度的增加，接種組多肽清除活性不斷上升，逐漸接近抗氧化肽GSH，最終在5 mg/mL時(shí)與其無顯著差異，達(dá)到92.14%。而Xing Lujuan等利用G-25凝膠層析柱、離子交換柱、高效液相色譜等分離方法純化得到宣威火腿多肽的DPPH自由基清除能力為74.45%。Oh等發(fā)現(xiàn)綠茶提取物的DPPH自由基清除能力為82.54%。這些結(jié)果表明發(fā)酵香腸粗肽液具有較高的抗氧化活性。香腸多肽具有較高DPPH自由基清除活性的關(guān)鍵可能在于其多肽成分及氨基酸組成，正如Yu Di等結(jié)果顯示接種組香腸多肽含有更高比例的疏水氨基酸可能有更強(qiáng)的清除自由基能力。由圖1B可發(fā)現(xiàn)，接種組粗肽液在5 mg/mL時(shí)清除羥自由基的能力接近60%，比對照組高出近1 倍。在其他質(zhì)量濃度時(shí)接種組也都顯著高于對照組，但都低于GSH。如表1所示，對照組和GSH的ABTS陽離子自由基清除能力顯著高于接種組（＜0.05）。相反地，Karwowska等發(fā)現(xiàn)接種乳酸菌的羊肉會(huì)產(chǎn)生更多多肽，且清除ABTS陽離子自由基的活性更強(qiáng)。這可能是由于多肽氨基酸的組成和含量不同。據(jù)研究酪氨酸和半胱氨酸的存在會(huì)顯著提高多肽ABTS陽離子自由基清除能力，以及組氨酸在特定位置時(shí)肽鏈抗氧化活性會(huì)更強(qiáng)。

如圖1C所示，接種發(fā)酵香腸粗肽液Fe螯合能力與對照組和GSH相比顯著升高，最高為53.31%。Zaky等發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量為3～10 kDa的米糠蛋白水解物的金屬離子絡(luò)合能力最高為61.04%。推測原因可能是多肽含有的酸性氨基酸如天冬氨酸側(cè)鏈中包含的氨基和羧基有較強(qiáng)的螯合 Fe的能力，抑制了自由基的產(chǎn)生，與Phongthai等的結(jié)果一致。相似地，發(fā)酵劑可能改變了粗肽液的氨基酸組成從而提高了其Fe螯合能力?？偨Y(jié)來說，接種發(fā)酵香腸多肽具有更高的體外抗氧化能力。這可能因?yàn)榛旌习l(fā)酵劑促進(jìn)香腸蛋白水解，暴露了更多疏水性氨基酸殘基如亮氨酸、脯氨酸，或者增加了一些特定氨基酸的含量提高了清除自由基的能力。但這需要進(jìn)一步對粗肽液進(jìn)行純化鑒定后得到驗(yàn)證。

圖1 21 d接種組和對照組香腸中不同質(zhì)量濃度多肽的抗氧化活性Fig. 1 Antioxidant activity of different concentrations of peptides derived from naturally and starter fermented sausage

表1 接種組和對照組發(fā)酵香腸多肽的ABTS陽離子自由基清除能力Table 1 ABTS radical cation scavenging activity of T peptides derived from naturally and starter fermented sausage

2.2 體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 接種發(fā)酵香腸源多肽對小鼠生長性能的影響

生物體抗氧化能力和生長免疫功能有密切的聯(lián)系，脾臟是機(jī)體的主要免疫器官。由表2可知，-半乳糖構(gòu)建的氧化模型組小鼠體質(zhì)量與其他組小鼠沒有顯著差異（＞0.05）。各組小鼠的胰臟指數(shù)、心臟指數(shù)差異均不顯著（＞0.05）。但高肽添加組雄雌小鼠的脾臟指數(shù)顯著高于氧化模型組小鼠（＜0.05）。結(jié)果表明：在-半乳糖刺激后，添加接種發(fā)酵香腸源多肽可以有效減少和緩和小鼠臟器指數(shù)的下降，促進(jìn)小鼠正常生長。初歡歡等得到了相同的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)小鼠體質(zhì)量不受人工合成肽的影響，但臟器指數(shù)顯著提高。也有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)大豆活性肽對斷奶仔豬的生長性能有顯著的促進(jìn)作用，但是對臟器發(fā)育沒有顯著影響。推測可能是不同來源的活性肽側(cè)重于不同的生理功能。發(fā)酵香腸源抗氧化肽干預(yù)后可明顯提高脾臟系數(shù)，其或許可以抑制器官老化、增強(qiáng)免疫功能，但后續(xù)需要更深入研究對生長和免疫性能的影響。

表2 接種發(fā)酵香腸源多肽對小鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)的影響（n＝6）Table 2 Effect of peptides from starter fermented sausage on body mass and viscera indices of mice (n = 6)

2.2.2 接種發(fā)酵香腸源多肽對小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.2.2.1 接種發(fā)酵香腸源多肽對小鼠血清抗氧化酶活性的影響

SOD可以有效清除超氧陰離子自由基，是抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一。GSH-PX和CAT也是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的重要組成酶，能清除體內(nèi)多余的HO和羥自由基，阻止脂質(zhì)的氧化。

表3 接種發(fā)酵香腸源多肽對小鼠血清抗氧化酶的影響（n＝6）Table 3 Effect of peptides from starter fermented sausage on antioxidant enzyme activities in serum of mice (n = 6)

由表3可知，氧化模型組小鼠血清中SOD、GSH-PX活性顯著低于其他各組（＞0.05），而低肽組、高肽組及VC對照組小鼠血清SOD、GSH-PX活性之間無顯著差異（＞0.05），說明-半乳糖加劇小鼠細(xì)胞氧化，導(dǎo)致抗氧化酶活性降低，而添加接種發(fā)酵香腸源多肽可以減少氧化刺激，加固防線，增加抗氧化酶SOD、GSH-PX活性，甚至優(yōu)于添加VC組的抗氧化效果。與氧化模型組相比，添加高含量接種發(fā)酵香腸源多肽的小鼠血清CAT活性顯著增加，以上結(jié)果表明在-半乳糖刺激后，氧化組血清中抗氧化酶活性顯著下降。而添加了接種發(fā)酵香腸源多肽后，可以使抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX恢復(fù)甚至高于正常水平，這與Sun Yangying等的研究結(jié)果相似。Sun Yangying等利用-半乳糖誘導(dǎo)氧化小鼠測定雞蛋白水解物的體內(nèi)抗氧化能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水解物能顯著提高SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶活性。You Lijun等用木瓜蛋白酶水解泥鰍肉制備泥鰍多肽，發(fā)現(xiàn)泥鰍多肽可以提高SOD、CAT和GSH-Px活性改善小鼠內(nèi)源性細(xì)胞抗氧化活性，但提高SOD活性的幅度較小。

2.2.2.2 接種發(fā)酵香腸源多肽對小鼠血清T-AOC的影響

T-AOC全面直接地反映機(jī)體酶和非酶抗氧化系統(tǒng)應(yīng)對外界刺激的調(diào)節(jié)能力，是代表機(jī)體抗氧化能力的關(guān)鍵指標(biāo)。由圖2可知，添加高質(zhì)量濃度粗肽液顯著提高氧化模型組小鼠T-AOC，效果優(yōu)于添加VC組。低質(zhì)量濃度粗肽液緩和了衰老小鼠的氧化程度，但沒有顯著差異。添加接種發(fā)酵香腸源多肽后，小鼠血清抗氧化酶活性和T-AOC能力一致提高，說明抗氧化肽對提高血清抗氧化能力有較好效果。因此，接種發(fā)酵香腸源多肽對小鼠衰老的抑制作用可能部分源于它們對血清抗氧化酶系統(tǒng)的影響。

圖2 接種發(fā)酵香腸源多肽對小鼠血清T-AOC的影響Fig. 2 Effect of peptides from starter fermented sausage on serum T-AOC in mice

2.2.3 接種發(fā)酵香腸源粗肽液對小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

2.2.3.1 接種發(fā)酵香腸源粗肽液對小鼠肝臟抗氧化酶活性的影響

由表4可知，-半乳糖刺激后，模型組雄、雌小鼠肝臟組織的SOD（61.89、59.80 U/mg）、CAT（36.38、34.62 U/mg）活性顯著低于其他各組（＜0.05），結(jié)合本研究及前人文獻(xiàn)得出-半乳糖誘導(dǎo)氧化模型組抗氧化酶活性顯著低于對照組，表明-半乳糖可以引起體內(nèi)大量過氧化物的產(chǎn)生，成功構(gòu)建了動(dòng)物氧化模型。添加低含量接種發(fā)酵香腸源多肽能提高CAT活性達(dá)到正常水平，提高粗肽液添加量后，CAT活性顯著增加，高含量接種發(fā)酵香腸抗氧化肽對CAT活性的恢復(fù)效果甚至優(yōu)于VC，呈現(xiàn)一定的量效依賴關(guān)系。與氧化模型組相比，高肽組小鼠SOD活性顯著提高，恢復(fù)到正常水平，和VC對照組作用效果相當(dāng)。低肽添加組小鼠SOD水平和氧化模型組沒有顯著差異（＞0.05）。添加接種發(fā)酵香腸源多肽對小鼠肝臟GSH-PX活性沒有顯著影響，而添加VC能顯著提高小鼠GSH-PX活性。但與之相反的是，接種發(fā)酵香腸源多肽能夠改善小鼠血清中GSH-PX活性，祝超智也得到了相同的研究結(jié)果。推測可能是因?yàn)樵诟闻K中抗氧化肽中所含的谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸等合成GSH-PX的前體物質(zhì)被消化。此外，接種發(fā)酵香腸源多肽的給予方式可能會(huì)影響其在血清和肝臟中吸收程度。

綜合以上結(jié)果表明，在-半乳糖刺激后，氧化模型組肝臟中抗氧化酶活性顯著下降，而添加了接種發(fā)酵香腸源多肽后，可以使抗氧化酶 SOD、CAT恢復(fù)到正常水平，但是對GSH-PX活性的作用效果不顯著，深入分析得出接種發(fā)酵香腸抗氧化肽能限制活性氧類氧化損傷，直接清除自由基，維持機(jī)體功能。

表4 接種發(fā)酵香腸源多肽對小鼠肝臟抗氧化酶的影響（n＝6）Table 4 Effect of peptides from starter fermented sausage on antioxidant enzyme activities in liver of mice (n = 6)

2.2.3.2 接種發(fā)酵香腸源粗肽液對小鼠肝臟氧化物質(zhì)積累的影響

MDA水平間接反映組織中脂質(zhì)過氧化的程度。由圖3可知，氧化模型組雄雌小鼠肝臟中的MDA含量達(dá)到4 nmol/mg左右（＜0.05），而低肽添加組、VC對照組及高肽添加組小鼠肝臟MDA含量分別比氧化模型組降低了48%、55%和68%（＜0.05）。這說明-半乳糖氧化促使細(xì)胞產(chǎn)生過量氧活性自由基，使氧化模型組小鼠肝臟MDA含量顯著增加，與前文結(jié)果一致。而添加接種發(fā)酵香腸源多肽恢復(fù)效果甚至優(yōu)于添加 VC組，都可以避免體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的不斷積累，有效減輕肝臟的脂質(zhì)過氧化損傷，具有顯著的抗氧化作用。值得注意的是，添加發(fā)酵香腸源粗肽液后，小鼠MDA含量顯著減少，但均不能使其恢復(fù)到正常狀態(tài)，這與Xu Fangzhi和馬麗艷等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。說明抗氧化劑只能在一定程度上減輕-半乳糖造成的氧化損失，并不能完全抑制脂質(zhì)氧化。從抗氧化基因表達(dá)上看，王麗英發(fā)現(xiàn)花生四烯酸代謝生物通路可能會(huì)影響玉米抗氧化肽氧化作用，通過抑制基因表達(dá)提高修復(fù)產(chǎn)物的水平。但在體內(nèi)發(fā)酵香腸抗氧化肽發(fā)揮抗氧化效應(yīng)的途徑仍需深入研究，可以通過體外細(xì)胞培養(yǎng)和熒光定量等手段，在細(xì)胞和基因水平上探討抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系和發(fā)揮作用的機(jī)制。

圖3 接種發(fā)酵香腸源抗氧化肽對小鼠肝臟氧化物質(zhì)積累的影響Fig. 3 Effect of peptides from starter fermented sausage on MDA level in liver of mice

3 結(jié) 論

研究對接種發(fā)酵香腸源多肽的體內(nèi)外抗氧化作用進(jìn)行了較為系統(tǒng)的評(píng)價(jià)。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接種發(fā)酵增強(qiáng)了香腸粗肽液的DPPH自由基、羥自由基清除活性和Fe螯合能力，達(dá)到強(qiáng)于GSH的水平。發(fā)酵劑會(huì)增強(qiáng)香腸多肽的體外抗氧化活性。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種發(fā)酵香腸抗氧化肽能夠提高小鼠脾臟指數(shù)，增強(qiáng)血清和肝臟SOD、CAT、GSH-PX特征抗氧化酶活性和T-AOC，減少M(fèi)DA生成，減緩氧化損傷，最終表明其具有良好的抗衰抗氧化作用，為發(fā)酵香腸抗氧化肽作為天然抗氧化劑提供了參考依據(jù)。雖然推測接種發(fā)酵香腸源粗肽液作用機(jī)制是可以直接抑制自由基的產(chǎn)生，相應(yīng)地減少SOD、CAT、GSH-PX消耗，保護(hù)抗氧化防御系統(tǒng)，但具體的通路還需要更多驗(yàn)證。