吳凱云，徐子惠，郭 健，楊曉泉 ，孟赫誠(chéng)

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，食物蛋白與膠體研究中心，廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

日益增長(zhǎng)的世界人口與有限的自然資源之間的矛盾已成為全球化問題，而動(dòng)物性食品生產(chǎn)比植物性食品生產(chǎn)需要消耗更多的自然資源，同時(shí)會(huì)排放更多的溫室氣體。除了可持續(xù)發(fā)展與環(huán)境壓力，動(dòng)物蛋白對(duì)健康的負(fù)面影響和動(dòng)物福利等因素也是“植物基”風(fēng)潮掀起的主要驅(qū)動(dòng)力。人們嘗試以植物蛋白代替動(dòng)物蛋白，目前已有許多基于植物蛋白的產(chǎn)品被開發(fā)以替代肉類或其他動(dòng)物制品。盡管取得了初步成功，但植物性替代品仍然面臨諸多挑戰(zhàn)，其食品安全特性和營(yíng)養(yǎng)問題還未得到充分解決。目前，尚未明確植物蛋白在人體中發(fā)揮健康效應(yīng)的作用機(jī)制。

研究食物的健康效應(yīng)，有必要研究食物在人體胃腸道消化過程中的變化。食物的消化是一個(gè)復(fù)雜的過程，食物經(jīng)口腔咀嚼形成食糜進(jìn)入消化道，消化道主要發(fā)生兩方面的作用：機(jī)械分解作用，包括口腔咀嚼和胃蠕動(dòng)；酶促轉(zhuǎn)化作用，人體胃腸道內(nèi)存在多種酶，會(huì)將大分子物質(zhì)水解為可以被小腸上皮細(xì)胞吸收的小分子物質(zhì)。植物蛋白經(jīng)胃腸消化后轉(zhuǎn)化為小分子多肽，在人體中起健康效應(yīng)的是多肽而不是蛋白本身。因此，要剖析植物蛋白的健康效應(yīng)，需首先理解植物蛋白在胃腸道的水解過程和變化。

近年來，多個(gè)體外消化模型已被廣泛應(yīng)用于研究食物在胃腸道消化過程中的變化及其對(duì)人體健康的影響。INFOGEST組織于2014年提出了一套標(biāo)準(zhǔn)化的、適用于各種研究目的、模擬成人消化的體外靜態(tài)模型，并于2019年發(fā)布了INFOGEST 2.0版本。在每個(gè)消化階段，該體外靜態(tài)消化實(shí)驗(yàn)均在恒定pH值和酶濃度下進(jìn)行。此模型具有簡(jiǎn)單、易操作，可以有效預(yù)測(cè)結(jié)果的特點(diǎn)，但也存在一些局限性；此模型過分簡(jiǎn)化了消化生理過程，未能模仿消化過程的動(dòng)態(tài)方面，比如消化液的連續(xù)分泌，胃排空等動(dòng)力學(xué)。Kong等在2010年開發(fā)的HGS模型模擬了胃消化的動(dòng)態(tài)過程，可用于研究胃消化過程中酸和酶的分泌及收縮力等生理?xiàng)l件對(duì)食物分解動(dòng)力學(xué)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放的影響。但該模型的構(gòu)建比較復(fù)雜，且設(shè)備昂貴，維護(hù)成本較高，不具備普適性?；谏鲜鲆蛩?，Mulet-Cabero等在INFOGEST體外靜態(tài)模型的基礎(chǔ)上提出半動(dòng)態(tài)消化模型，對(duì)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)模型進(jìn)行簡(jiǎn)化，特別關(guān)注了胃消化階段的關(guān)鍵動(dòng)力學(xué)。該模型雖然不能模仿胃部的蠕動(dòng)收縮，但可以實(shí)現(xiàn)HGS模型中的連續(xù)胃分泌和胃排空的機(jī)制，并可以提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和結(jié)構(gòu)變化的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。此外，大部分實(shí)驗(yàn)室都具備構(gòu)建該模型的條件。

大豆是優(yōu)質(zhì)蛋白的主要來源，是中國(guó)膳食模式的重要組成部分，其加工產(chǎn)物大豆蛋白，產(chǎn)量大、價(jià)格低廉、氨基酸組成合理，是最廣泛用作植物基產(chǎn)品開發(fā)的植物蛋白之一。因此，本研究以大豆蛋白為研究對(duì)象，分別采用INFOGEST靜態(tài)消化模型和半動(dòng)態(tài)消化模型評(píng)價(jià)經(jīng)透析處理和未經(jīng)透析處理的大豆蛋白的胃消化特性，并比較兩種消化模型的適用性，為研究植物蛋白的健康效應(yīng)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕 山東御馨生物科技有限公司。

胃蛋白酶（酶活力≥2 500 U/mg），α-淀粉酶（酶活力≥500 U/mg）、Nα-苯甲酰-L-精氨酸-4-硝基苯胺鹽酸鹽西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA） 源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純；所有實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

CR 22GII高速離心機(jī) 日本Hitachi公司；Rapid N Cube杜馬斯定氮儀 德國(guó)Elementar公司；888型pH電位滴定儀 瑞士Metrohm公司；LSP01-1A微量注射泵河北保定蘭格恒流泵有限公司；TS-3D圓周旋轉(zhuǎn)搖床江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；DYCZ-24KF四板垂直電泳儀 北京六一生物科技有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆蛋白的制備與理化性質(zhì)測(cè)定

將粉碎的脫脂豆粕與去離子水以1∶10（g/mL）混合，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至8.0，室溫下低速攪拌2 h，8 000 r/min離心20 min后，取上清液冷凍干燥，得到未透析的大豆蛋白（SP-ND），室溫保存?zhèn)溆?。將上述上清液裝入透析袋（截留分子質(zhì)量14 kDa），在去離子水中于4 ℃透析48 h后冷凍干燥，得到透析的大豆蛋白（SP-D），室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

用杜馬斯燃燒法測(cè)定兩種蛋白的蛋白含量。稱取約100 mg樣品于錫箔紙上，經(jīng)包裹、壓片置于杜馬斯定氮儀的自動(dòng)進(jìn)樣盤中。儀器燃燒管溫度960 ℃；二級(jí)燃燒管溫度800 ℃；還原管溫度810 ℃；二氧化碳?jí)毫? 200～1 250 mbar；流速650 mL/min。

參考Gao等的方法測(cè)定大豆蛋白的植酸含量。稱取樣品0.5 g，用2.4%鹽酸溶液（m/m）配成25 mg/mL大豆蛋白溶液，攪拌1 h，5 000 r/min離心15 min。取上清液加入1.0 g NaCl，攪拌20 min，4 ℃靜置1 h，再5 000 r/min離心15 min。取0.5 mL上清液，加入4.5 mL去離子水和4.0 mL顯色液（0.03%六水三氯化鐵+0.3%二水合-5-磺基水楊酸），混勻，靜置20 min，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。配制梯度質(zhì)量濃度植酸溶液（0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL），取1.0 mL植酸溶液，按上述方法測(cè)定吸光度，根據(jù)質(zhì)量濃度與吸光度繪制植酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

參考王英男等和華蕾的方法測(cè)定大豆蛋白的胰蛋白酶抑制劑活性。

1.3.2 體外模擬靜態(tài)消化模型的建立

根據(jù)Brodkorb等的方法建立體外模擬INFOGEST靜態(tài)消化模型，并略作改動(dòng)。將適量大豆蛋白分散于去離子水中配成3.6%蛋白溶液（m/m），室溫?cái)嚢? h，將pH值調(diào)為7.0。取5.0 g蛋白溶液與模擬唾液（simulated salivary fluid，SSF）1∶1（g/mL）混合，其中α-淀粉酶在整個(gè)體系中的酶活力為75 U/mL，在37 ℃水浴中保溫2 min。然后與模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）1∶1（V/V）混合，在加入胃蛋白酶前將pH值調(diào)至3.0，胃蛋白酶在整個(gè)體系的酶活力為2 000 U/mL，在37 ℃水浴中分別反應(yīng)不同時(shí)間（0、5、10、30、60、90、120 min）。最后用2 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)至7.2終止反應(yīng)，在-20 ℃放置保存。SSF與SGF模擬消化液的成分如表1所示。

表1 SSF與SGF模擬消化液的組成Table 1 Composition of SSF and SGF mmol/L

1.3.3 體外模擬半動(dòng)態(tài)消化模型的建立

根據(jù)Mulet-Cabero和Ye Anqian等的方法建立體外模擬半動(dòng)態(tài)消化模型，并略作改動(dòng)。如圖1所示，該模型用于模擬胃部的半動(dòng)態(tài)消化。pH電位滴定儀恒定滴加SGF（pH 1.5）并記錄消化過程中的pH值變化，用微量注射泵滴加胃蛋白酶溶液，3D圓周旋轉(zhuǎn)搖床模擬胃糜的混合，水浴循環(huán)泵模擬37 ℃的恒溫環(huán)境。將適量大豆蛋白分散于去離子水中配成3.6%蛋白溶液（m/m），室溫?cái)嚢? h，將pH值調(diào)為7.0。取50 mL蛋白溶液與10 mL SSF（用NaCl代替NaHCO，下述SGF同）混合，37 ℃反應(yīng)2 min，然后與17.5 mL基礎(chǔ)胃液（模擬禁食狀態(tài)，含14 mL SGF和3.5 mL胃蛋白酶溶液）混合，反應(yīng)開始并計(jì)時(shí)。SGF流速0.5 mL/min，胃蛋白酶溶液質(zhì)量濃度5 mg/mL（酶活力為1 101 U/mL），流速0.125 mL/min，排空速率為0.75 mL/min，每隔15 min從容器底部取樣模擬排空，即排空內(nèi)容物。將排空內(nèi)容物的pH值調(diào)為7.2終止反應(yīng)，冷凍干燥，然后稱其質(zhì)量，將不同時(shí)間點(diǎn)排空內(nèi)容物的質(zhì)量累加計(jì)算排空程度。

圖1 半動(dòng)態(tài)消化模型Fig. 1 Photograph of semi-dynamic digestion system

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定

根據(jù)Laemmli的方法，并略作改動(dòng)。在還原條件下，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析消化產(chǎn)物的分子組成。將樣品稀釋液與上樣緩沖液、去離子水混合，然后放入沸水中加熱5 min。采用DYCZ-24KF四板垂直電泳儀，膠板厚度1.5 mm，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，上樣量15 μL。于恒壓下進(jìn)行電泳，樣品在濃縮膠中電壓80 mV，進(jìn)入分離膠后調(diào)為120 mV。采用0.1%考馬斯亮藍(lán)R250對(duì)膠片進(jìn)行染色30 min，之后使用乙醇乙酸脫色液（乙醇∶乙酸∶水＝100∶100∶800，V/V）進(jìn)行脫色。

1.3.5 消化產(chǎn)物的游離氨基含量測(cè)定

根據(jù)Duque-Estrada等的方法，采用OPA法測(cè)定游離氨基含量。取200 μL稀釋后的樣品，與1.5 mL OPA試劑混合，避光反應(yīng)3 min，在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

配制梯度質(zhì)量濃度絲氨酸溶液（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL），取200 μL絲氨酸溶液，按上述方法測(cè)定吸光度，繪制絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 靜態(tài)消化產(chǎn)物中不溶性蛋白含量測(cè)定

將5%三氯乙酸溶液加入到靜態(tài)消化產(chǎn)物溶液中（1.66∶1，V/V），以10 400 r/min離心20 min，棄上清液，將沉淀烘干，冷卻后稱量其質(zhì)量直至質(zhì)量無變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)（P＜0.05）。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，用Origin 2019 b軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種大豆蛋白的基本理化性質(zhì)

如表2所示，SP-ND的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（58.24±0.84）%，SP-D的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（81.07±0.57）%。未經(jīng)酸沉制備的大豆蛋白保留了較多碳水化合物、礦物質(zhì)等成分，因此，本研究制得兩種大豆蛋白的蛋白含量明顯低于大豆分離蛋白含量（約90%）。此外，透析可將鹽離子、低聚糖等小分子物質(zhì)除去，故SP-D的蛋白含量高于SP-ND。

從表1可知，透析對(duì)大豆蛋白的植酸含量有一定影響。王睿粲研究發(fā)現(xiàn)生豆乳中一部分植酸以游離的形式存在，一部分植酸傾向于通過Ca/Mg與大豆蛋白7S組分結(jié)合，所以透析可能減少大豆蛋白中游離植酸含量。此外，兩種大豆蛋白的胰蛋白酶抑制劑活性差異顯著。大豆中的胰蛋白酶抑制劑主要有兩種，Kunitz型（KTI）和Bowman-Brik型抑制劑（BBTI），其分子質(zhì)量分別為20 kDa和8 kDa。透析不能除去胰蛋白酶抑制劑，但隨著蛋白質(zhì)純度的提高，胰蛋白酶抑制劑也被濃縮，因此SP-D的胰蛋白酶抑制活性高于SP-ND。

表2 大豆蛋白的基本理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of SP-D and SP-ND

2.2 兩種大豆蛋白靜態(tài)消化產(chǎn)物的分析

2.2.1 SDS-PAGE分析

如圖2所示，觀察兩種大豆蛋白消化后的電泳條帶（泳道2～8），發(fā)現(xiàn)兩種蛋白的條帶變化趨勢(shì)一致，7S的α（68 kDa）、α’（72 kDa）亞基在第10分鐘消失，48～63 kDa之間的條帶隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，其原因在于α、α’亞基和β亞基（52 kDa）的核心區(qū)高度同源，α、α’亞基各具有一個(gè)帶糖鏈的延展區(qū)，β亞基只有核心區(qū)。隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，天然大豆分離蛋白的α、α’亞基的延展區(qū)被消化，抵抗消化的核心區(qū)富集在48～63 kDa之間。11S酸性多肽（28～42 kDa）的條帶在第10分鐘消失；堿性多肽（18～20 kDa）條帶隨著消化時(shí)間強(qiáng)度逐漸降低。消化結(jié)束時(shí)，第120分鐘所對(duì)應(yīng)的電泳條帶主要是7S的β亞基和11S的堿性多肽，這與Santos-Hernández等的研究結(jié)果一致。在INFOGEST靜態(tài)消化模型中，兩種大豆蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解后，多肽組成和水解程度基本一致。

圖2 SP-ND（A）和SP-D（B）的INFOGEST靜態(tài)消化SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE patterns of SP-ND (A) and SP-D (B) subjected to INFOGEST static digestion

2.2.2 游離氨基含量分析

圖3 大豆蛋白INFOGEST靜態(tài)消化過程中游離氨基含量變化Fig. 3 Changes in free amino content during INFOGEST static digestion of soy protein

消化產(chǎn)物的游離氨基含量可以反映蛋白質(zhì)的水解程度。如圖3所示，SP-ND和SP-D的游離氨基含量在消化初期上升較快，尤其是消化前10 min，此后增長(zhǎng)趨緩。消化結(jié)束時(shí)，SP-ND為（0.50±0.02） mmol/g，SP-D為（0.41±0.01）mmol/g。

2.2.3 不溶性蛋白質(zhì)量濃度分析

如圖4所示，兩種大豆蛋白的消化產(chǎn)物經(jīng)三氯乙酸處理后，發(fā)生聚集沉淀，其不溶性蛋白的質(zhì)量濃度均隨消化進(jìn)程呈持續(xù)下降的趨勢(shì)，這表明大豆蛋白被逐漸消化降解成多肽。在消化的前10 min，SP-ND和SP-D不溶性蛋白的質(zhì)量濃度迅速下降，隨后下降趨勢(shì)變緩；消化120 min后，兩者不溶性蛋白的質(zhì)量濃度均為5.2 mg/mL。

圖4 大豆蛋白INFOGEST靜態(tài)消化過程中不溶性蛋白質(zhì)量濃度的變化Fig. 4 Changes in insoluble protein content during INFOGEST static digestion of soy protein

由兩種大豆蛋白靜態(tài)消化產(chǎn)物的SDS-PAGE、游離氨基含量及不溶性蛋白質(zhì)量濃度的結(jié)果分析可知，以INFOGEST靜態(tài)消化模型對(duì)SP-ND和SP-D進(jìn)行模擬胃消化，蛋白質(zhì)逐漸水解成多肽；在此過程中，兩者水解產(chǎn)物的組成基本一致，水解程度和消化速率基本相近。

2.3 兩種大豆蛋白半動(dòng)態(tài)消化產(chǎn)物的分析

2.3.1 半動(dòng)態(tài)消化過程pH值及外觀變化

如圖5所示，SP-ND和SP-D的初始pH值在6.9左右，在整個(gè)消化過程中，SP-ND的pH值基本呈線性下降趨勢(shì)；第120分鐘，pH值下降至2.3。在消化的前75 min，SP-D的pH值幾乎呈線性下降，此后pH值下降趨緩；第120分鐘，pH值下降至1.8。在整個(gè)消化過程中，經(jīng)過透析的大豆蛋白pH值均明顯低于SP-ND。

圖5 大豆蛋白半動(dòng)態(tài)消化過程中pH值變化Fig. 5 pH changes during semi-dynamic digestion of soy protein

圖6 大豆蛋白半動(dòng)態(tài)消化過程中的外觀圖Fig. 6 Appearance of soy protein during semi-dynamic digestion

大豆蛋白的等電點(diǎn)為pH 5左右，pH值接近等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的表面電荷被屏蔽，在疏水相互作用下容易發(fā)生聚集。如圖6所示，在消化開始時(shí)大豆蛋白溶液就出現(xiàn)大量沉淀。在Wang Xin等評(píng)估豆?jié){胃消化過程中結(jié)構(gòu)變化的研究中也出現(xiàn)了類似的情況，豆?jié){在消化初期pH 6.59時(shí)發(fā)生了聚集，推測(cè)初期的沉淀可能是由胃蛋白酶的作用引起的。整個(gè)消化過程中沉淀的變化與pH值變化息息相關(guān)。由圖5和圖6可知，SP-ND在第15和30分鐘時(shí)的pH值分別為5.5和5.1，均靠近等電點(diǎn)，所以這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有大量沉淀；第45分鐘pH值下降至4.6，遠(yuǎn)離等電點(diǎn)，沉淀明顯驟減。SP-D類似，在第30分鐘，沉淀明顯驟減。由于SP-ND的pH值一直高于SP-D，在消化至第105分鐘，SP-ND消化液仍然有較多沉淀且呈渾濁狀態(tài)，而SP-D消化液澄清，僅底部能觀察到少量白色沉淀。

2.3.2 SDS-PAGE分析

如圖7所示，在排空內(nèi)容物中，SP-ND的電泳條帶在前45 min無明顯變化，說明此時(shí)排空內(nèi)容物中仍有大量未水解的蛋白質(zhì)；第60分鐘，各個(gè)亞基的條帶顏色開始變淺；第75分鐘，7S的α、α’亞基消失；第90分鐘，11S的酸性多肽消失，直至消化結(jié)束時(shí)，7S的β亞基和11S的堿性多肽還有不同程度的保留。在排空內(nèi)容物中，SP-D的電泳條帶變化類似，只是在第45分鐘，各亞基條帶的顏色開始變淺。雖然消化結(jié)束時(shí)SP-ND和SP-D亞基組成相同，但SP-ND的消化進(jìn)程至少比SP-D慢15 min。

圖7 SP-ND（A）和SP-D（B）在半動(dòng)態(tài)消化過程中的SDS-PAGE圖譜Fig. 7 SDS-PAGE patterns of SP-ND (A) and SP-D (B) during semi-dynamic digestion

2.3.3 排空內(nèi)容物的干物質(zhì)及其游離氨基含量分析

兩種大豆蛋白在半動(dòng)態(tài)消化過程排空內(nèi)容物的質(zhì)量變化如圖8A所示，與消化過程中的外觀圖可相互印證。SP-ND排空內(nèi)容物干物質(zhì)的質(zhì)量呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)：消化第30分鐘，該值達(dá)到最高，為0.62 g；因?yàn)椋藭r(shí)pH值最接近等電點(diǎn)，聚集程度最高；30 min后其質(zhì)量開始下降。SP-D的排空內(nèi)容物干物質(zhì)的質(zhì)量則從15 min開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。SP-D在消化30 min后排空內(nèi)容干物質(zhì)的質(zhì)量均低于SP-ND。這可能是因?yàn)镾P-ND消化過程中一直有明顯的沉淀，故排空取樣時(shí)仍有較多的干物質(zhì)；另外，SP-ND溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較高（6.1%），可能導(dǎo)致其干物質(zhì)的質(zhì)量高于SP-D。

兩種大豆蛋白排空內(nèi)容物累積質(zhì)量占總固形物質(zhì)量的比值隨消化過程的變化如圖8B所示。SP-ND累積排空為83%，SP-D累積排空為87%；兩者胃糜排空50%時(shí)對(duì)應(yīng)的時(shí)間（t）分別為44、29 min，可用來衡量胃排空速率。

圖8 大豆蛋白半動(dòng)態(tài)消化過程中排空內(nèi)容物干物質(zhì)的質(zhì)量（A）及累積排空程度（B）Fig. 8 Dry matter mass of emptied digesta (A) and cumulative amount of emptied digesta (B) of soy protein during semi-dynamic digestion

如圖9所示，游離氨基含量的變化趨勢(shì)與其排空內(nèi)容物干物質(zhì)質(zhì)量變化相似。SP-ND整體呈先增加后下降的趨勢(shì)，消化第30分鐘游離氨基含量最高，為1.03 mmol/g；60 min后，游離氨基含量無明顯變化。SP-D的游離氨基含量在消化前60 min呈下降趨勢(shì)，之后無明顯變化。

圖9 大豆蛋白半動(dòng)態(tài)消化過程中排空內(nèi)容物的游離氨基含量變化Fig. 9 Changes in free amino group content in emptied digesta of soy protein during semi-dynamic digestion

以半動(dòng)態(tài)消化模型對(duì)SP-ND和SP-D進(jìn)行模擬胃消化，各種表征的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以相互印證，表明SP-ND的半動(dòng)態(tài)消化進(jìn)程至少比SP-D慢15 min。

3 討 論

在INFOGEST靜態(tài)消化模型中，pH值維持在3左右，pH 3是胃蛋白酶的最適pH值，該模型重點(diǎn)關(guān)注酶與底物之間的關(guān)系。但人體內(nèi)胃消化是一個(gè)逐漸酸化的過程，在食糜進(jìn)入胃部15 min內(nèi)，人體胃部pH值從禁食時(shí)的2.0快速上升至4.5～6.7；隨后，由于胃酸的逐漸分泌，該pH值逐漸下降。半動(dòng)態(tài)消化模型正是模擬了胃內(nèi)逐漸酸化的過程，在這個(gè)過程中，蛋白質(zhì)從接近等電點(diǎn)到遠(yuǎn)離等電點(diǎn)，發(fā)生聚集、組裝，Singh團(tuán)隊(duì)報(bào)道的一系列基于HGS模型的關(guān)于蛋白質(zhì)胃消化研究，表明蛋白質(zhì)在胃消化過程中發(fā)生的聚集、組裝等結(jié)構(gòu)變化會(huì)影響胃排空和胃消化速率；此外pH值影響胃蛋白酶的活性。因此pH值變化是半動(dòng)態(tài)消化過程中的關(guān)鍵影響因素。

在半動(dòng)態(tài)消化過程中，SP-ND的pH值變化比SP-D慢，從消化產(chǎn)物表征可知，SP-ND的消化進(jìn)程比SP-D至少慢15 min。兩種大豆蛋白的pH值變化趨勢(shì)不同，反映的是緩沖能力的差異。從圖5可知，SP-ND的緩沖能力比SP-D的緩沖能力強(qiáng)。緩沖能力定義為加入酸或堿后對(duì)pH值變化的抵抗力，蛋白質(zhì)的緩沖能力來自多肽鏈上的可電離基團(tuán)，包括氨基酸側(cè)鏈、末端氨基和末端羧基。

食物緩沖能力除了受固有因素，如蛋白質(zhì)含量、氨基酸組成、有機(jī)酸含量等影響，也會(huì)受到脂肪、碳水化合物、顆粒大小等影響，這些因素會(huì)影響H擴(kuò)散或者影響H與蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸的反應(yīng)。兩種大豆蛋白溶液蛋白質(zhì)含量相同，均為3.6%左右；氨基酸組成基本一致；推測(cè)緩沖能力的差異可能主要是因?yàn)閮烧叱煞值牟町悾瑑烧叩鞍缀肯嗖罴s23%，未經(jīng)透析的SP-ND成分比SP-D復(fù)雜；其次是固形物含量的差異，SP-ND質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.1%，SP-D質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.4%。

比較兩種大豆蛋白采用兩種消化模型消化后的電泳圖譜，可知水解程度基本一致。故如果僅考察蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物和水解程度，那么兩種消化模型均適用，其中INFOGEST靜態(tài)模型程序更簡(jiǎn)單，易操作。而半動(dòng)態(tài)消化模型的優(yōu)點(diǎn)在于可以獲得蛋白質(zhì)在消化過程中的聚集、組裝信息。因此可以根據(jù)不同的研究目的采用不同的消化模型。

4 結(jié) 論

采用INFOGEST靜態(tài)消化模型和半動(dòng)態(tài)消化模型研究未經(jīng)透析和經(jīng)透析的大豆蛋白的胃消化特性。結(jié)果表明：未經(jīng)透析和經(jīng)透析的大豆蛋白在靜態(tài)消化過程中無明顯差異；在半動(dòng)態(tài)消化過程中存在胃排空和消化速率等差異，未經(jīng)透析處理的大豆蛋白保留較多大豆中的成分，使其緩沖能力更強(qiáng)，胃排空滯后，蛋白質(zhì)消化速率減慢。此外，比較兩種體外消化模型，半動(dòng)態(tài)消化模型易于獲得蛋白質(zhì)在消化過程中的聚集、組裝信息。本研究結(jié)果將為基于大豆蛋白的產(chǎn)品的開發(fā)和健康效應(yīng)提供新的見解。