朱麗飛，陳 盼，趙玉叢，王篤學(xué)，李利紅

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

博落回注射液是《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2017年版)》中藥卷中收錄的制劑，為罌粟科植物博落回Macleayacordata(Willd.) R. Br.的果實(shí)經(jīng)提取分離制成的生物堿硫酸鹽滅菌水溶液[1]。博落回注射液含有多種異喹啉類生物堿[2]，具有抗菌消炎等功能，主要用于治療仔豬白痢、黃痢等疾病[3-5]。目前，《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2017年版)》主要采用薄層色譜法對博落回注射液中博落回總堿進(jìn)行定性鑒別，采用紫外-可見分光光度法檢查吸光度，要求吸光度不得低于0.55[1]，但是由于缺少含量測定項(xiàng)導(dǎo)致市售博落回注射液質(zhì)量不一。血根堿和白屈菜紅堿是博落回提取物中最主要的生物堿，也是博落回注射液中的主要有效成分。因此，本論文旨在以血根堿和白屈菜紅堿為有效成分指標(biāo)，建立HPLC同時(shí)測定博落回注射液中血根堿和白屈菜紅堿的含量測定方法，以評價(jià)不同廠家博落回注射液的質(zhì)量差異。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

甲醇購自天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；乙腈購自安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆涣姿?、濃鹽酸等購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；血根堿及白屈菜紅堿對照品購自上海源葉生物科技有限公司；博落回注射液四批(規(guī)格5 mL)，分別購自吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司(廠家A，批號20201104)、四川積善之家藥業(yè)有限公司(廠家B，批號20201101)、山東圣旺藥業(yè)有限公司(廠家C，批號20201101)、合肥強(qiáng)力動(dòng)物藥品有限責(zé)任公司(廠家D，批號20200902)。

1.2 主要儀器

E2695-Waters高效液相色譜儀購自沃特世科技上海有限公司；KQ-200KDE 超聲波清洗機(jī)購自昆山市超聲儀器有限公司；ESJ-S分析天平購自沈陽龍騰電子有限公司；SHZ-95B循環(huán)水多用真空泵購自鞏義市予華儀器有限公司。

1.3 色譜條件

色譜柱為Waters-symmetry C18(5 μm, 4.6×250 mm)；檢測器為2489 UV-Vis，檢測波長為270 nm；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～5 min，A∶B=25∶75；5～12 min，A∶B=60∶40；12～15 min，A∶B=25∶75；15～20 min，A∶B=25∶75)；流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL,柱溫為30 ℃。

1.4 溶液的制備

1.4.1 對照品溶液的制備

分別精密稱量血根堿對照品9.90 mg、白屈菜紅堿對照品11.70 mg于10 mL容量瓶中，加入1%鹽酸-甲醇溶液(50∶50)4 mL，超聲溶解，自然冷卻后加上述溶液定容至10 mL，搖勻，分別制成每1 mL含血根堿0.99 mg的溶液和每1 mL含白屈菜紅堿1.17 mg 的溶液作為對照品儲(chǔ)備液。分別精密量取血根堿儲(chǔ)備液0.5 mL、白屈菜紅堿儲(chǔ)備液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，用1%鹽酸-甲醇(50∶50)定容，作為混合對照品溶液(1 mL含血根堿49.5 μg、白屈菜紅堿117 μg)。

1.4.2 供試品溶液的制備

分別精密量取不同廠家的博落回注射液0.1 mL于10 mL容量瓶中，用1%鹽酸-甲醇(50∶50)稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取血根堿對照品溶液、白屈菜紅堿對照品溶液、混合對照品溶液各5 μL，按照1.3所述的色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖1～2，系統(tǒng)適用性結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明血根堿保留時(shí)間約4.8 min，白屈菜紅堿保留時(shí)間約7.3 min，供試品溶液中血根堿和白屈菜紅堿的保留時(shí)間與對照品基本一致，且與相鄰成分色譜峰完全分離(分離度>1.5)，理論塔板數(shù)以血根堿峰計(jì)算大于5 000。

表1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 混合對照品色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察

精密量取血根堿對照品儲(chǔ)備液適量，通過逐步稀釋配制成99.0、49.5、19.8、9.90、4.95、1.98 μg/mL的一系列血根堿對照品溶液。另精密量取白屈菜紅堿對照品儲(chǔ)備液適量，通過逐步稀釋配制成117、58.5、23.4、11.7、5.85、2.34 μg/mL一系列白屈菜紅堿對照品溶液。精密吸取各對照品溶液5 μL，在1.3色譜條件下進(jìn)樣測定，以峰面積A為縱坐標(biāo)，分別以血根堿對照品濃度、白屈菜紅堿對照品濃度c(μg/mL)為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。血根堿的回歸方程為y=14258x-4574.6(R2=0.9978)，在1.98～99.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；白屈菜紅堿的回歸方程為y=25895x-951.09(R2=0.9978)，在2.34～117 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

通過檢測日內(nèi)精密度和日間精密度評價(jià)儀器的精密度。取1.4.1混合對照品溶液，按照1.3色譜條件進(jìn)行測定，日內(nèi)精密度同一天連續(xù)進(jìn)樣6次，日間精密度連續(xù)3天每天連續(xù)進(jìn)樣3次，分別計(jì)算血根堿和白屈菜紅堿峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果如表2～3所示。血根堿和白屈菜紅堿的日內(nèi)精密度RSD分別為0.18%、0.15%，血根堿和白屈菜紅堿的日間精密度RSD分別為0.72%、0.32%，表明儀器精密度良好。

表2 日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 日間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取1.4.1混合對照品溶液，按1.3項(xiàng)色譜條件分別在1、2、4、12、24 h進(jìn)樣，記錄不同時(shí)間血根堿和白屈菜紅堿的峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果如表4所示，其中血根堿的RSD為0.44%(n=5)，白屈菜紅堿的RSD為0.20%(n=5)，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密量取廠家A博落回注射液9份，每份0.1 mL，置于10 mL容量瓶中，分別按高(約150%)、中(約100%)、低(約50%)3個(gè)梯度加入血根堿對照品儲(chǔ)備液(0.99 mg/mL)和白屈菜紅堿對照品溶液(58.5 μg/mL)適量，每個(gè)梯度3份，用1%鹽酸-甲醇(50∶50)稀釋至刻度，搖勻，制備加樣回收樣品溶液，在使用1.3色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算血根堿和白屈菜紅堿的平均回收率和RSD值，結(jié)果如表5所示。血根堿的平均回收率(高、中、低)分別為103.01%、99.07%、100.82%，RSD值(高、中、低)分別為0.63%、1.80、1.15%；白屈菜紅堿的平均回收率(高、低、中)分別為102.45%、99.09%、99.57%，RSD值(高、中、低)分別為0.59%、1.61%、2.21%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表5 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 樣品含量測定

將1.4.2配制的供試品溶液1.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，每個(gè)樣品平行測定2次，記錄峰面積，計(jì)算供試品溶液中血根堿和白屈菜紅堿的濃度，結(jié)果如表6和圖2～5所示。結(jié)果表明，廠家A博落回注射液中血根堿和白屈菜紅堿的濃度分別為4.560、1.266 mg/mL，每支(5 mL)博落回注射液中血根堿和白屈菜紅堿的含量分別為22.80、6.831 mg；廠家B博落回注射液中血根堿和白屈菜紅堿的濃度分別為3.960、1.290 mg/mL，每支(5 mL)博落回注射液中血根堿和白屈菜紅堿的含量分別為19.80、6.449 mg；而廠家C、D均未檢出血根堿和白屈菜紅堿。

圖2 供試品溶液色譜圖(廠家A)

表6 博落回注射液中血根堿和白屈菜紅堿含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 色譜條件的確立

3.1.1 流動(dòng)相和洗脫方式的選擇

按照農(nóng)村農(nóng)業(yè)部第246號公告中博落回散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的色譜條件[6]，以乙腈為流動(dòng)相A、以0.2%三乙胺溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5)為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果血根堿和白屈菜紅堿色譜峰均出現(xiàn)分叉。因此結(jié)合參考文獻(xiàn)[7-9]，以乙腈為流動(dòng)相A、0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，同時(shí)調(diào)節(jié)進(jìn)樣體積至5 μL，比較等度洗脫(A∶B=25∶75)和梯度洗脫(見1.3)的差異，發(fā)現(xiàn)等度洗脫時(shí)血根堿和白屈菜紅堿峰峰形較寬，且白屈菜紅堿出現(xiàn)分叉，而梯度洗脫時(shí)分叉現(xiàn)象消失，拖尾現(xiàn)象有所改善，但白屈菜紅堿拖尾現(xiàn)象仍存在，且加入掃尾劑三乙胺拖尾現(xiàn)象并未改善。因此最終選擇流動(dòng)相和洗脫方式為乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～5 min，A∶B=25∶75；5～12 min，A∶B=60∶40；12～15 min，A∶B=25∶75；15～20 min，A∶B=25∶75)。

圖3 供試品溶液色譜圖(廠家B)

圖4 供試品溶液色譜圖(廠家C)

圖5 供試品溶液色譜圖(廠家D)

3.1.2 波長的選擇

根據(jù)參考文獻(xiàn)[7, 9, 10]，HPLC法測定血根堿和白屈菜紅堿的常用波長有270 nm和284 nm，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，血根堿和白屈菜紅堿在270 nm的吸收值均比284 nm吸收值大，因此選擇270 nm為檢測波長。

3.2 博落回注射液質(zhì)量差異分析

廠家A、B的博落回注射液中均能有效檢出血根堿和白屈菜紅堿，每支(5 mL)博落回注射液中兩種有效成分總含量分別為29.63、26.25 mg，大于25 mg，滿足說明書規(guī)格要求(5 mL∶25 mg)；而廠家C、D的博落回注射液中均不含血根堿和白屈菜紅堿兩種有效成分，且均檢測出未知色譜峰(廠家C∶tR=5.558 min；廠家D∶tR=2.381 min)；表明廠家A、B的博落回注射液成分含量接近，而廠家C、D與廠家A、B的成分差異較大，說明目前市售博落回注射液質(zhì)量差異較大。

目前《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》博落回注射液缺少含量測定項(xiàng)，無法統(tǒng)一進(jìn)行評價(jià)，導(dǎo)致目前市售博落回注射液質(zhì)量不一，存在以次充好的現(xiàn)象。本論文結(jié)合參考文獻(xiàn)，通過反復(fù)優(yōu)化色譜條件，建立了簡單、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的測定博落回注射液中血根堿和白屈菜紅堿含量的HPLC法，并且評價(jià)了四個(gè)廠家博落回注射液的質(zhì)量，為博落回注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。