張昱，孔繁林，吳磊

[1.山西白求恩醫(yī)院（山西醫(yī)學科學院），山西太原 030032；2.山西農業(yè)大學生命科學學院，山西晉中 030801]

神經源性膀胱（neurogenic bladder, NB）是由于中樞神經系統(tǒng)損傷導致的膀胱尿道功能障礙，主要表現(xiàn)為尿不暢或潴留，嚴重時引發(fā)尿路感染或腎衰竭，造成死亡[1]。脊柱損傷是造成NB 的主要原因，其中以骶上脊髓損傷（suprasacral spinal cord injury,SSCI）最常見[2]。中醫(yī)將其歸為“癃閉”“遺溺”等范疇[3]。目前NB 主要采用手術和保守治療，但手術效果有限且創(chuàng)傷較大，中醫(yī)以湯藥與針灸治療最常見。目前針對SSCI 后NB 采用針刺較多，而湯藥與針灸聯(lián)合治療的研究較少，且尚無確切的作用機制[4]。為提高療效，本研究選用中藥與電針聯(lián)合治療。湯藥選用通腑茯苓飲進行調理，該藥方是根據(jù)《金匱要略》中葵子茯苓散加減而來，具有通調水道、行氣利水的功效[5]。針刺則選用長強穴和維胞穴進行電針治療。長強穴屬督脈，位于脊柱骨的尾端，督陽初始之處，能夠增強督脈陽氣，調暢通淋，治療大小便難解；維胞穴則位于下腹部，主治遺尿，尿潴留等，具有調理沖任，行氣止痛的功效[6]。為探究其聯(lián)合治療的效果及作用機制，本研究復制SSCI后NB 大鼠模型，探究通腑茯苓飲聯(lián)合電針治療大鼠SSCI 后NB 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

45 只SPF 級、SD 雌性大鼠，體重190～220 g，平均（205±15）g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2019-0030。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑通腑茯苓飲所用藥材（山西國藥醫(yī)藥集團有限公司），戊巴比妥鈉（CAS 號：57-33-0，上海譜析生物科技有限公司，貨號：XY-TP276000），中性甲醛（CAS 號：50-00-0，上海遠慕生物科技有限公司，貨號：YR0267），TRIzol 試劑盒（武漢純度生物科技有限公司，貨號：CD-13433-ML），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）試劑盒（廣州市銳博生物科技有限公司，貨號：MQPS），神經生長因子（nerve growth factor, NGF）、神經生長因子受體（nerve growth factor receptor, TrkA）單克隆抗體（北京安諾倫生物科技有限公司，NGF 抗體貨號：LM12882；TrkA 抗體貨號：LM21146）。

1.2.2 主要儀器咬骨鉗（蘇州威邦醫(yī)療器械有限公司），一次性針灸針（型號：25mm，北京漢醫(yī)醫(yī)療器械中心），SDZ-Ⅱ型華佗牌電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），基礎電泳儀（型號：Mini-protean tetra mini，美國Bio-Rad 公司），真空干燥箱（型號：FD8-3T，美國GOLD-SIM 公司），紫外分光光度計（型號：BioSpectrometerD30，德國Eppendorf 公司）。

1.3 方法

1.3.1 SSCI 模型的復制及分組所有大鼠飼養(yǎng)于SPF 區(qū)域，溫度保持在20℃左右，濕度為55%～60%，大鼠食量一般為100 g/（kg·d），每日給予充足的飼料和水。根據(jù)Hassan Shakerl 脊髓橫斷法[7]，復制大鼠SSCI 模型。采用隨機數(shù)字表法將45 只雌性大鼠分為對照組（8 只）和實驗組（37 只）。實驗組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后復制SSCI 模型。將大鼠俯臥固定，脊柱胸椎下段消毒、備皮，找到T10椎體，從此處切開皮膚，分離皮下組織，暴露T10、T11棘突及椎板，用咬骨鉗咬除T10椎板及兩側關節(jié)突，暴露出脊髓并將其切斷（可反復切割，確保脊髓完全切斷，無神經纖維殘留），觀察大鼠生命體征后縫合。大鼠清醒后，采用病理評分評估大鼠脊髓橫斷情況[7]：0 分（后肢癱瘓，無任何運動）表明脊髓橫斷成功。術后抗感染治療7 d，每日手法排尿，并記錄尿量。2 周后膀胱出現(xiàn)尿潴留，表明大鼠SSCI 后NB 模型復制成功。實驗組5 只大鼠模型復制失敗（3 只死亡，2 只未出現(xiàn)尿潴留），其余大鼠隨機分為模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯(lián)合組，每組8 只。

1.3.2 藥物處理通腑茯苓飲組方：茯苓10 g、車前子15 g、烏藥6 g、琥珀3 g、黃芪30 g、白術20 g、澤瀉10 g、冬葵子10 g、通草6 g、滑石10 g、牛膝15 g，制成生藥含量為1 g/mL 的通腑茯苓飲，備用。模型復制成功后，根據(jù)人與大鼠的體重及給藥劑量換算公式[9]，通腑茯苓飲組給予通腑茯苓飲6.25 g/（kg·d），連續(xù)服用14 d；電針組采用0.3 mm×25.0 mm 的電針，對長強穴和維胞穴進行針刺，電針儀參數(shù)設定為10/50 Hz（疏波10 Hz/5 s，密波50 Hz/9 s），留針20 min，1 次/d，連續(xù)14 d。

1.3.3 標本采集及處理最后一次治療后對大鼠進行尿流動力學檢測。檢測后所有大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，采用手法輔助大鼠排尿，記錄其殘余尿量。在麻醉狀態(tài)下剝離大鼠背部皮膚、肌肉及組織，分離暴露胸椎段T8～T12脊髓，切除T9～T10脊髓后用生理鹽水沖洗，每組4 只大鼠的脊髓于4%中性甲醛中固定，用于蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色；另4 只大鼠的脊髓置于-80℃冷凍保存，用于檢測mRNA 和蛋白的表達。

1.3.4 大鼠尿流動力學檢測排空膀胱后，大鼠仰臥位固定，將三通導管中的空氣排空，一端由尿道插入膀胱并固定，一端連接測壓通道，另一側連接微量灌注泵，記錄膀胱基礎壓力后，向膀胱中勻速注入溫生理鹽水（0.2 mL/min），密切觀察膀胱壓力變化，當尿道口有液體流出時，記錄此時壓力值，為膀胱漏尿點壓力，此時注入的生理鹽水容量為膀胱最大容量。液體流出后繼續(xù)注入溫生理鹽水，至逼尿肌壓力穩(wěn)定，根據(jù)公式計算得出膀胱順應性。膀胱順應性=膀胱容量的變化/壓力變化。

1.3.5 大鼠脊髓組織HE 染色及病理學評分取固定好的脊髓組織標本，70%乙醇脫水，透明，石蠟包埋，切片厚約4 μm，HE 染色，封片后置于光鏡下觀察脊髓組織病理變化，并進行病理學評分。0 分：無炎癥細胞浸潤，1 分：炎癥細胞僅出現(xiàn)在血管周圍；2～4 分：脊髓周圍出現(xiàn)輕、中、重度炎癥細胞浸潤[10]。

1.3.6 qRT-PCR 檢測大鼠脊髓組織NGF、TrkA mRNA 的表達取部分冷凍保存的脊髓組織，根據(jù)TRIzol 試劑盒說明書提取脊髓組織總RNA，采用紫外吸收法檢測純度及濃度，以總RNA 為模板，逆轉錄為cDNA，qPCR 反應體系：SYBR 4 μL，正反向引物各1 μL，cDNA 模板4 μL，H2O 加至20 μL；擴增條件：95℃預變性2 min；95℃變性10 s，58℃退火15 s，72℃延伸10 s，共40 個循環(huán)。β-actin 為內參基因，采用2-ΔΔCT法計算脊髓組織NGF、TrkA mRNA 相對表達量，NGF、TrkA 及內參引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.7 Western blotting 檢測大鼠脊髓組織NGF、TrkA 蛋白的表達取冷凍保存的脊髓組織研磨勻漿，加入裂解液對組織進行裂解，測定蛋白濃度，電泳分離目的蛋白，采用PVDF 膜進行轉膜，用Western洗滌液洗去轉膜液，封閉1 h，按一抗說明書進行稀釋，加入一抗NGF、TrkA 及內參后在4℃條件下，搖床孵育過夜，再加入山羊抗兔二抗，孵育2 h，最后顯影得到結果[11]。蛋白相對表達量=目的蛋白積分光密度值（IOD）/β-Actin IOD。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠膀胱重量、殘余尿量比較

對照組、模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯(lián)合組大鼠膀胱重量、殘余尿量比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=90.861 和27.951，均P=0.000）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯(lián)合組的膀胱重量、殘余尿量增加（P＜0.05）；與模型組比較，通腑茯苓飲組、電針組及聯(lián)合組的膀胱重量、殘余尿量減少（P＜0.05）；與通腑茯苓飲組比較，電針組及聯(lián)合組的膀胱重量、殘余尿量減少（P＜0.05），與電針組比較，聯(lián)合組的膀胱重量、殘余尿量減少（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠膀胱重量、殘余尿量比較 （n=8，±s）

表2 各組大鼠膀胱重量、殘余尿量比較 （n=8，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與通腑茯苓飲組比較，P ＜0.05；④與電針組比較，P ＜0.05。

組別對照組模型組通腑茯苓飲組電針組聯(lián)合組F 值P 值膀胱重量/g 0.18±0.04 0.86±0.08①0.79±0.03①②0.68±0.07①②③0.56±0.13①②③④90.861 0.000殘余尿量/mL 0.16±0.04 3.25±1.08①2.26±0.62①②1.65±0.47①②③1.16±0.39①②③④27.951 0.000

2.2 各組大鼠尿流動力學指標比較

對照組、模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯(lián)合組大鼠膀胱漏尿點壓力、膀胱順應性及膀胱最大容量比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=25.988、23.317 和63.828，均P=0.000）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯(lián)合組的膀胱漏尿點壓力升高，膀胱順應性降低、膀胱最大容量減少（P＜0.05）；與模型組比較，通腑茯苓飲組、電針組及聯(lián)合組的膀胱漏尿點壓力降低，膀胱順應性升高、膀胱最大容量增加（P＜0.05）；與通腑茯苓飲組比較，電針組及聯(lián)合組的膀胱漏尿點壓力降低，膀胱順應性升高、膀胱最大容量增加（P＜0.05），與電針組比較，聯(lián)合組的膀胱漏尿點壓力降低，膀胱順應性升高、膀胱最大容量增加（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠尿流動力學指標比較 （n=8，±s）

表3 各組大鼠尿流動力學指標比較 （n=8，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與通腑茯苓飲組比較，P ＜0.05；④與電針組比較，P ＜0.05。

膀胱最大容量/mL 4.58±1.04 0.66±0.15①1.12±0.17①②1.85±0.21①②③2.56±0.55①②③④63.828 0.000組別對照組模型組通腑茯苓飲組電針組聯(lián)合組F 值P 值膀胱漏尿點壓力/cmH2O 36.18±2.34 53.46±5.71①46.68±3.63①②42.64±3.56①②③38.97±2.63①②③④25.988 0.000膀胱順應性/（mL/cmH2O）0.31±0.11 0.03±0.01①0.08±0.03①②0.13±0.05①②③0.20±0.07①②③④23.317 0.000

2.3 各組大鼠脊髓組織病理變化及評分比較

HE 染色結果顯示，對照組脊髓結構完整，神經細胞核膜清晰，分布均勻，無明顯炎癥細胞浸潤；模型組可見炎癥細胞浸潤，血管周圍可見“管套狀”結構；與模型組比較，通腑茯苓飲組、電針組及聯(lián)合組炎癥細胞浸潤減少，局部可見“管套狀結構”。見圖1。

圖1 各組大鼠脊髓組織病理切片 （HE染色×200）

對照組、模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯(lián)合組大鼠脊髓組織病理評分分別為（0.00+0.00）分、（3.61±0.38）分、（2.68±0.28）分、（1.91±0.20）分和（1.02±0.11）分，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=143.713，P=0.000）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯(lián)合組病理評分升高（P＜0.05）；與模型組比較，通腑茯苓飲組、電針組及聯(lián)合組病理評分降低（P＜0.05）；與通腑茯苓飲組比較，電針組及聯(lián)合組病理評分降低（P＜0.05），與電針組比較，聯(lián)合組病理評分降低（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠脊髓組織NGF、TrkA mRNA 相對表達量比較

對照組、模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯(lián)合組大鼠脊髓組織NGF、TrkA mRNA 相對表達量比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=63.286 和141.237 均P=0.000）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯(lián)合組NGF、TrkA mRNA 相對表達量降低（P＜0.05）；與模型組比較，通腑茯苓飲組、電針組及聯(lián)合組NGF、TrkA mRNA 相對表達量升高（P＜0.05）；與通腑茯苓飲組比較，電針組及聯(lián)合組NGF、TrkA mRNA 相對表達量升高（P＜0.05），與電針組比較，聯(lián)合組NGF、TrkA mRNA 相對表達量升高（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠脊髓組織NGF、TrkA mRNA相對表達量比較 （n=4，±s）

表4 各組大鼠脊髓組織NGF、TrkA mRNA相對表達量比較 （n=4，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與通腑茯苓飲組比較，P ＜0.05；④與電針組比較，P ＜0.05。

TrkA mRNA 1.37±0.06 0.66±0.04①0.83±0.04①②1.10±0.09①②③1.22±0.05①②③④141.237 0.000組別對照組模型組通腑茯苓飲組電針組聯(lián)合組F 值P 值NGF mRNA 0.94±0.04 0.56±0.02①0.71±0.03①②0.82±0.05①②③0.87±0.04①②③④63.286 0.000

2.5 各組大鼠脊髓組織NGF、TrkA 蛋白相對表達量比較

對照組、模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯(lián)合組大鼠脊髓組織NGF、TrkA 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=239.253 和72.746 均P=0.000）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，模型組、通腑茯苓飲組、電針組及聯(lián)合組NGF、TrkA 蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與模型組比較，通腑茯苓飲組、電針組及聯(lián)合組NGF、TrkA蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與通腑茯苓飲組比較，電針組及聯(lián)合組NGF、TrkA 蛋白相對表達量升高（P＜0.05），與電針組比較，聯(lián)合組NGF、TrkA 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。見表5 和圖2。

表5 各組大鼠脊髓組織NGF、TrkA蛋白相對表達量比較（n=4，±s）

表5 各組大鼠脊髓組織NGF、TrkA蛋白相對表達量比較（n=4，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與通腑茯苓飲組比較，P ＜0.05；④與電針組比較，P ＜0.05。

TrkA蛋白2.04±0.25 0.47±0.05①0.72±0.09①②0.84±0.08①②③1.30±0.16①②③④72.746 0.000組別對照組模型組通腑茯苓飲組電針組聯(lián)合組F 值P 值NGF蛋白1.43±0.04 0.71±0.05①0.89±0.04①②0.97±0.03①②③1.31±0.03①②③④239.253 0.000

圖2 各組大鼠脊髓組織NGF、TrkA蛋白的表達

3 討論

SSCI 后NB 是由中樞神經系統(tǒng)受損導致，中醫(yī)認為SSCI 后NB 的病機為淤血凝滯、督脈不同。電針能夠促進內源性神經干細胞增殖分化，有利于神經細胞的恢復。中醫(yī)常用電針治療NB，其在穴位功效的基礎上，采用電刺激，在穴位之間形成電流，更深度刺激穴位發(fā)揮功效。廖福金等[12]研究結果顯示，針刺長強穴能夠改善SSCI 后NB 大鼠的排尿能力，改善膀胱功能。因此，本研究選用長強穴和維胞穴進行電針刺激，2 個穴位能夠在體內形成一條電流，起到通督補腎、恢復膀胱氣化的作用[13]。加之通腑茯苓飲的利水、理氣加速代謝的作用，通過多方面對SSCI 后NB 進行調理，但其作用機制尚不確切。NGF、TrkA 對中樞神經元的發(fā)育、再生及功能特性的表達均有一定的調控作用。有研究證實，NGF、TrkA 能夠加速神經元的修復[14]，因此推測NGF-TrkA 信號通路在NB 中發(fā)揮一定作用。

本研究通過Hassan Shakerl 脊髓橫斷法復制SSCI 模型，該方法能夠完全橫斷脊髓并準確定位脊髓損傷部位，有利于后續(xù)切片觀察，且較為簡便。采用通腑茯苓飲、電針及兩者聯(lián)合對SSCI 后NB 的作用進行比較，結果表明通腑茯苓飲、電針治療SSCI 后NB 均有一定療效，其中聯(lián)合治療對于膀胱功能及尿流動力學指標的改善效果更明顯。本研究中大鼠脊髓組織病理變化及病理評分結果同樣證實聯(lián)合治療對大鼠脊髓組織的修復作用更明顯，能減少炎癥細胞浸潤。分析其原因為通腑茯苓飲由茯苓、車前子、烏藥、琥珀、黃芪、白術、澤瀉、冬葵子、通草、滑石、牛膝組成；其中茯苓健脾利水；車前子利水通淋；烏藥溫腎行氣，腎氣化生，致膀胱氣化，尿液排出；琥珀宣竅；重用黃芪補氣升陽，健脾益肺，利水消腫、活血化瘀，于補益中兼具通瀉之功；白術、澤瀉健脾利水，佐以冬葵子、滑石、通草，增強滑竅利水通淋之功；牛膝通經活血、利水通淋、祛除邪結[15]。通腑茯苓飲聯(lián)合電針刺激長強穴及維胞穴，能夠發(fā)揮通調水道、行氣利水的功效，同時強督脈陽氣，調暢通淋，多種作用途徑增強膀胱功能，使其效果顯著優(yōu)于通腑茯苓飲及電針單獨治療。

NGF 是神經營養(yǎng)因子中的一種，對神經的生長、損傷過程均有一定影響。此外，NGF 還可以保護細胞免受氧化應激損傷，TrkA 是NGF 受體，能夠促進神經元出芽，修復受損的神經回路[16]。當脊髓受損時，NGF 能促進神經細胞凋亡。本研究結果表明，SSCI 后NB 大鼠脊髓組織NGF、TrkA mRNA 和蛋白相對表達量降低，可能是檢測時NGF、TrkA 已處于高峰后的下降時期。經電針或通腑茯苓飲治療后，NGF、TrkA mRNA 和蛋白相對表達量升高，而兩者聯(lián)合治療后NGF、TrkA mRNA 和蛋白相對表達量接近正常水平。分析期原因為NGF 與受體TrkA 特異性結合后激活NGF，能夠維持神經元活性，加速突觸成熟，使軸突延長，促進中樞神經系統(tǒng)的發(fā)育和修復[17]。通腑茯苓飲可能通過激活P13K/Akt 信號通路，抑制脊髓損傷神經細胞的凋亡，促進神經元的出芽及神經回路的重建，加速神經再生，從而減輕脊髓損傷[18]。本研究結果提示通腑茯苓飲聯(lián)合電針能夠有效激活NGF-TrkA 信號通路，減輕SSCI 后NB 對大鼠膀胱及脊髓的損傷。

綜上所述，通腑茯苓飲聯(lián)合電針能夠改善SSCI后NB 大鼠膀胱功能，其作用機制可能與NGF-TrkA信號通路有關。未來可對NGF、TrkA 上下游蛋白進行深入研究，進一步驗證通腑茯苓飲聯(lián)合電針對NGF-TrkA 信號通路的調控作用，為治療SSCI 后NB提供科學依據(jù)。