王鋒存，趙秀麗，劉軍莉

（青海大學(xué)附屬醫(yī)院1.神經(jīng)內(nèi)科；2.老年病科，青海西寧 810001）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease, AD）是以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，起病隱匿，病程慢性遷延并進(jìn)行性發(fā)展，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。目前尚未完全明確AD 發(fā)病機(jī)制，近年研究證實(shí)神經(jīng)免疫炎癥反應(yīng)在其中發(fā)揮重要作用，以小膠質(zhì)細(xì)胞激活和炎癥細(xì)胞因子表達(dá)為主要特征[2-3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, LncRNA）是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA，轉(zhuǎn)移相關(guān)的肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1）和核旁斑組裝轉(zhuǎn)錄本1（nuclear paraspeckle assembly transcript 1, NEAT1）是近年來(lái)受到廣泛關(guān)注的LncRNA，研究指出LncRNA MALAT1 通過抑制核因子E2 相關(guān)因子2 表達(dá)，LncRNA NEAT1 通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路參與小膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)炎癥損傷[4-5]。目前關(guān)于LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1 與AD 患者炎癥因子和認(rèn)知功能的關(guān)系鮮有報(bào)道。本研究分析AD 患者血清LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1 的表達(dá)變化，探討其是否參與AD 炎癥反應(yīng)和認(rèn)知功能損傷。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2021年1月青海大學(xué)附屬醫(yī)院收治的AD 患者93 例為AD 組。其中，男性51 例，女性42 例；年齡48～84 歲，平均（64.88±7.36）歲；體質(zhì)量指數(shù)18～28 kg/m2，平均（23.47±2.20）kg/m2；病程1～11年，平均（5.24±1.18）年；文化程度：初中及以上65 例，小學(xué)28 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)（第4 版）》[6]的AD 診斷標(biāo)準(zhǔn)；②MRI 或CT 腦改變或腦萎縮；③臨床資料完整；④患者監(jiān)護(hù)人均知情研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①神經(jīng)活性藥物濫用史；②腦血管疾病、顱腦外傷等導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害；③嚴(yán)重感染疾?。虎芎喜⒆陨砻庖咝约膊?；⑤合并心、肝、腎等器質(zhì)性病變；⑥其他精神疾??；⑦存在攻擊行為或自殺傾向。另選取同期本院54 例體檢健康者為對(duì)照組。其中男性34 例，女性20 例；年齡54～86 歲，平均（65.25±8.14）歲；體質(zhì)量指數(shù)18～28 kg/m2，平均（23.54±2.17）kg/m2；文化程度：初中及以上38 例，小學(xué)16 例。兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 血清指標(biāo)檢測(cè)

采集受試者靜脈血，以3 000 r/min 離心10 min，離心半徑10 cm，取上清液，置于-80℃冰箱冷凍保存待檢。取部分血清，采用TRIzol 試劑盒提取血清總RNA，TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Narodrop 驗(yàn)證cDNA 濃度及純度，使OD260/OD280 為1.8～2.0，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRTPCR）擴(kuò)增。 LncRNA MALAT1 正向引物：5'-GCTCTAGACGCAGCCTCCAGCCCGAGACTTCT-3'，反向引物：5'-CGGGATCCGTAGGGCTTCTCAAAACACC AGCT-3'，長(zhǎng)度均296 bp；LncRNA NEAT1 正向引物：5'-CTTCCTCCCTTTAACTTATCCATTCAC-3'，反向引物：5'-CTCTTCCTCCACCATTACCAACAATAC-3'，長(zhǎng)度均244 bp。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性90 s、95℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃拉伸15 s，共40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參校正，正向引物：5'-TATGAT GATATCAAGAGGGTAGT-3'，反向引物：5'-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3'，長(zhǎng)度均22 bp。2-ΔΔCt法計(jì)算血清LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量。剩余血清采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）檢測(cè)超敏C 反應(yīng)蛋白（high-sensitivity C-reactive protein, hs-CRP），白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）水平，試劑盒購(gòu)自上海延慕實(shí)業(yè)有限公司，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 認(rèn)知功能評(píng)估

采用簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表（mini-mental state examination, MMSE）[7]評(píng)估受試者認(rèn)知功能，包括6個(gè)維度共30 個(gè)條目，分值0～30 分，分值越高則認(rèn)知功能越好，初中及以上受教育程度患者＜24 分、小學(xué)＜20 分、文盲＜17 分視為認(rèn)知功能障礙。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或中位數(shù)和四分位數(shù)間距M（P25，P75）表示，比較用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson 或Spearman 法；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清 LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量和MMSE評(píng)分比較

兩組血清LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1 相對(duì)表達(dá)量和MMSE 評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AD 組血清LncRNA MALAT1 相對(duì)表達(dá)量和MMSE 評(píng)分低于對(duì)照組，LncRNA NEAT1 相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組。見表1。

表1 兩組血清LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量和MMSE評(píng)分比較

2.2 兩組血清炎癥因子水平比較

兩組hs-CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AD 組高于對(duì)照組。見表2。

表2 兩組血清炎癥因子水平比較 （pg/mL，±s）

表2 兩組血清炎癥因子水平比較 （pg/mL，±s）

組別AD組對(duì)照組t 值P 值n 93 54 hs-CRP 3.10±0.60 1.87±0.42 14.575 0.000 IL-1β 38.03±8.04 27.41±5.79 8.503 0.000 IL-6 107.15±13.51 83.28±12.04 10.739 0.000 TNF-α 195.66±12.80 181.59±12.29 6.522 0.000

2.3 AD 患者血清LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1 表達(dá)與病程、MMSE 評(píng)分和炎癥因子的相關(guān)性

Pearson 或Spearman 相關(guān)性分析顯示，AD 患者血清LncRNA MALAT1 表達(dá)與MMSE 評(píng)分呈正相關(guān)（rs=0.587，P=0.000），與hs-CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平均呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.522、-0.601、-0.574和-0.577，均P=0.000），LncRNA NEAT1 表達(dá)與MMSE 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.593，P=0.000），與hs-CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α 均呈正相關(guān)（r=0.487、0.588、0.611 和0.573，均P=0.000）。

2.4 血清炎癥指標(biāo)和LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1表達(dá)對(duì)AD的診斷價(jià)值

ROC 曲線顯示，血清LncRNA MALAT1 診斷AD的AUC 為0.915（95% CI：0.858，0.955），最佳臨界值為0.98，其對(duì)應(yīng)的敏感性為94.62%（95% CI：87.92，98.22），特異性為81.48%（95% CI：68.61，90.70）；血清LncRNA NEAT1 診斷AD 的AUC 為0.858（95% CI：0.791，0.910），最佳臨界值為2.37，其對(duì)應(yīng)的敏感性為90.32%（95% CI：82.45，95.52），特異性為72.22%（95%CI：58.44，83.57）。見表3 和圖1。

表3 血清炎癥指標(biāo)和LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1表達(dá)診斷AD的效能分析

圖1 血清炎癥指標(biāo)和LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1表達(dá)診斷AD的ROC曲線

3 討論

AD 是導(dǎo)致老年人失能的重要原因，發(fā)病率逐年增高，2020年我國(guó)AD 患者約900 萬(wàn)，到2050年預(yù)計(jì)將增加至2 100 萬(wàn)[8]。早期識(shí)別AD 有助于改變腦結(jié)構(gòu)、功能和行為水平的可塑性，延緩病情進(jìn)展，減輕功能障礙，增強(qiáng)患者社會(huì)參與力，改善生活質(zhì)量。目前尚未完全明確AD 發(fā)病機(jī)制，主流觀點(diǎn)認(rèn)為錯(cuò)誤折疊的β-淀粉樣蛋白（amyloid βprotein, Aβ）于大腦中沉積形成淀粉樣蛋白斑塊和Tau 蛋白過度磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)纖維糾纏是AD 最主要的病理特征[9]。研究發(fā)現(xiàn)，Aβ 斑塊沉積周圍存在大量活化小膠質(zhì)細(xì)胞，與Aβ 大量產(chǎn)生導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活有關(guān)，小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)又能誘導(dǎo)Aβ 大量產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)參與AD 進(jìn)展[10]。近年實(shí)驗(yàn)也表明，非甾體類抗炎藥能顯著改善Aβ 沉積和認(rèn)知功能[11]。上述研究提示神經(jīng)炎癥反應(yīng)參與AD 病理、生理過程，研究其相關(guān)細(xì)胞因子對(duì)AD 早期診斷、治療具有重要意義。

LncRNA 是一類轉(zhuǎn)錄本＞200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，攜帶多種信息并具有重要調(diào)節(jié)功能，已被證實(shí)參與腦卒中、AD、帕金森等多種神經(jīng)炎癥反應(yīng)疾病過程[3]。LncRNA MALAT1 位于染色體11q13.1，首次由JI 等[12]在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)，并認(rèn)為是非小細(xì)胞肺癌預(yù)后標(biāo)志物。近年來(lái)大量研究證實(shí)LncRNA MALAT1 還參與其他惡性腫瘤進(jìn)展，并參與其他非腫瘤疾病發(fā)生、發(fā)展過程。SHANG 等[13]研究顯示，腦缺血或再灌注損傷小鼠模型海馬中LncRNA MALAT1 表達(dá)下調(diào)，增加LncRNA MALAT1表達(dá)具有抑制神經(jīng)元凋亡、縮小梗死體積、改善學(xué)習(xí)和記憶功能等作用。PATEL 等[14]研究顯示，創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型腦組織LncRNA MALAT1 表達(dá)下調(diào)，增加LncRNA MALAT1 表達(dá)能抑制腦組織中IL-1β、TNF-α 等炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，抑制神經(jīng)炎癥。上述研究提示LncRNA MALAT1 與神經(jīng)炎癥反應(yīng)和認(rèn)知功能密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，AD 組血清LncRNA MALAT1 表達(dá)低于對(duì)照組，提示LncRNA MALAT1 參與AD 發(fā)病過程。MMSE 為臨床AD 患者智力狀態(tài)和認(rèn)知功能評(píng)估方式，hs-CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α 是AD 患者血清中常見異常炎癥細(xì)胞因子。本研究結(jié)果證實(shí)，LncRNA MALAT1低表達(dá)與AD 患者炎癥反應(yīng)升高和認(rèn)知功能降低密切相關(guān)，其機(jī)制可能與AD 患者腦組織炎癥反應(yīng)引起LncRNA MALAT1 表達(dá)抑制，LncRNA MALAT1 低表達(dá)導(dǎo)致miR-125b 表達(dá)升高。miR-125b 作為AD 重要的生物標(biāo)志物，在促進(jìn)Aβ 大量分泌、抑制神經(jīng)突生長(zhǎng)、誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。研究表明，LncRNA MALAT1 能靶向下調(diào)miR-125b表達(dá)，降低IL-6、TNF-α 表達(dá)，抑制AD 模型神經(jīng)炎癥和凋亡，促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)[16]。

LncRNA NEAT1 也位于人染色體11q13.1，因該染色體是癌癥多發(fā)的基因位點(diǎn)，因此近年來(lái)大量研究報(bào)道了其在癌癥中的作用，如LncRNA NEAT1能通過海綿miR-486-5p 調(diào)節(jié)核受體4A1/Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[17]。近年研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA NEAT1 還參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如KUKHARSKY 等[18]研究顯示，敲除小鼠LncRNA NEAT1 基因可損害小鼠社交能力，但對(duì)小鼠認(rèn)知功能、運(yùn)動(dòng)功能無(wú)影響。NI等[19]研究顯示，敲低腦缺血或再灌注損傷小鼠LncRNA NEAT1 可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞向促炎M1 表型極化，抑制神經(jīng)元凋亡。有研究顯示，LncRNA NEAT1 能靶向miR-107 加重Aβ 過度沉積誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷[20]。本研究結(jié)果顯示，AD 組血清LncRNA NEAT1 表達(dá)高于對(duì)照組，提示LncRNA NEAT1 參與AD 發(fā)病過程。進(jìn)一步分析證實(shí)，LncRNA NEAT1過表達(dá)與AD 患者炎癥反應(yīng)和認(rèn)知功能降低密切相關(guān)，其機(jī)制可能與LncRNA NEAT1 可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向促炎表型極化，釋放炎癥細(xì)胞因子，損害神經(jīng)功能有關(guān)[18]。β 分泌酶1 是IL-6、TNF-α 等炎癥細(xì)胞因子誘發(fā)的AD 重要促進(jìn)因子，能通過增加Aβ表達(dá)參與AD 發(fā)生、發(fā)展[21]。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA NEAT1 能通過海綿miR-124 上調(diào)β 分泌酶1 表達(dá)[22]。提示LncRNA NEAT1 高表達(dá)還可能通過增加Aβ 表達(dá)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化，釋放炎癥細(xì)胞因子，參與AD 發(fā)生、發(fā)展。筆者評(píng)估了血清炎癥指標(biāo)和LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1 表達(dá)對(duì)AD 的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1 表達(dá)診斷AD 的AUC 分別為0.915 和0.858，顯著大于血清hs-CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平，說(shuō)明血清LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1 表達(dá)對(duì)AD 具有良好的診斷價(jià)值。

綜上所述，AD 患者血清LncRNA MALAT1 低表達(dá)，LncRNA NEAT1 高表達(dá)，兩者可能參與AD 炎癥反應(yīng)和認(rèn)知功能損傷，可作為AD 診斷標(biāo)志物。但本研究樣本量有限，且有關(guān)LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1 與AD 的作用機(jī)制尚未完全明確，還需進(jìn)一步研究。