謝駿，高鳳敏，符北京

（牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院心內(nèi)科，黑龍江牡丹江 157011）

缺血性心肌病居世界致死原因的首位，具有高發(fā)病率和病死率等特點，而缺血再灌注與其病死率居高不下密切相關(guān)[1-2]。缺血再灌注損傷主要指血流灌注逐漸恢復后，組織結(jié)構(gòu)受損或功能喪失進一步加重的現(xiàn)象[3-4]。缺血再灌注后造成的損傷較先前更為嚴重，且持續(xù)時間更長，可直接影響患者的重要臟器，致其結(jié)構(gòu)和功能受損。盡早、盡快恢復冠狀動脈的血流灌注是治療心肌梗死，提高患者存活率的關(guān)鍵。MURRY 等[5]提出，心肌缺血預處理可對心肌起到保護作用。有研究證實，吸入麻醉藥預處理和后處理可有效減輕心肌缺血再灌注損傷。近年來有研究顯示，AMPK 在調(diào)節(jié)人體氧化應(yīng)激和細胞凋亡、增殖等過程中發(fā)揮了較大作用[6]。激活后的AMPK 可通過多種途徑促進ATP 的生成和脂肪酸的氧化?，F(xiàn)有臨床證據(jù)顯示，激活狀態(tài)的AMPK可對心肌細胞起到保護作用[7-8]。CTRP9 是一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪組織源性細胞因子，參與吞噬細胞清除凋亡細胞、調(diào)控機體炎癥反應(yīng)及免疫耐受等生理過程[9]。

目前關(guān)于CTRP9 調(diào)控AMPK 途徑參與遠端缺血預處理對心肌梗死模型心肌缺血再灌注致腦損傷的保護作用的報道較少。因此本研究通過復制缺血再灌注模型大鼠，分別給予后處理和CTRP9 抑制劑干預來明確CTRP9 通過調(diào)控AMPK 途徑發(fā)揮心肌保護作用的機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物雄性SD 大鼠40 只，SPF 級，體重220～250 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2020-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK（黑）2021-0002。

1.1.2 主要試劑戊巴比妥鈉、蘇木精、CTRP9 抑制劑LiCI（美國Sigma 公司），TUNRL 試劑盒（美國羅氏公司），p-AMPK（1∶1 000，批號：2535，美國Cell Signaling 公司）、一抗LC3（1∶1 000，批號：136F3，美國Santa Cruz 公司）、一抗P62（1∶1 000，批號：8G10，美國Santa Cruz 公司）、內(nèi)參GAPDH（1∶1 000，批號：AG019，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），苦味酸、伊紅Y、二甲苯、石蠟、中性樹膠（北京中國國藥集團），拘橡酸、拘橡酸鈉（北京華科盛精細化工產(chǎn)品貿(mào)易公司），鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶、SABC 試劑盒、DAB 顯色試劑盒、白細胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）多克隆抗體、IL-8 多克隆抗體、IL-10 多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），Bal-2 多克隆抗體、Bax 多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 主要儀器高精度電子天平、pH 計（PB10）（德國Sartorius 公司），移液器、離心機（德國Eppendorf 公司），切片機（德國Leica 公司），PVDF 膜（美國Millipore 公司），熒光顯微鏡（德國Axiophot 公司），全自動生化分析儀（美國Beckman 公司），Image-Pro6.0 計算機圖像分析軟件（美國Media Cybemetics 公司），凝膠成像系統(tǒng)、電泳槽（美國Bio-Rad 公司），普通光學顯微鏡、BX50 顯微攝影系統(tǒng)（日本Olympus 公司），V30 掃描儀（日本Epson 公司），-70℃深低溫冰箱（日本SANYO 公司），Bene View T5 型監(jiān)護儀（中國西安巨田醫(yī)療設(shè)備有限公司），動物呼吸機（上海嘉鵬科技有限公司），微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器有限公司），TGL-16G型高速臺式離心機（上海醫(yī)用電子儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型復制及分組所有大鼠插管開胸后，復制心肌缺血再灌注模型前，置于手術(shù)臺約10 min，期間不做任何處理，便于大鼠適應(yīng)呼吸機、開胸操作的損傷及胸腔壓力的改變。實驗期間對動物的處理均嚴格按照相關(guān)倫理學規(guī)定進行。將大鼠按隨機數(shù)字表法分為4 組，每組10 只：①假手術(shù)組（NS組）：大鼠在左心耳下緣位置心肌組織穿線，但對冠狀動脈左前降支不做結(jié)扎。②缺血再灌注組（NIR組）：大鼠在左心耳下緣位置穿線結(jié)扎冠狀動脈左前降支，進行缺血再灌注處理，缺血時長30 min，松開結(jié)扎線后繼續(xù)灌注2 h。③缺血預處理組（NIPost組）：大鼠在左心耳下緣位置穿線結(jié)扎冠狀動脈左前降支，缺血時長30 min，松開結(jié)扎線后再行3 次處理（將結(jié)扎線放松再灌注10 s，拉緊結(jié)扎線缺血10 s，循環(huán)3 個周期，最后松開結(jié)扎線行2 h 再灌注）。④缺血預處理+CTRP9 抑制劑組（NIPostI 組），術(shù)前10 min灌注0.3 mmol/kg 0.5% LiCl 抑制劑，余下后處理操作方法與NIPsot 組一致。

1.2.2 標本采集再灌注120 min 后迅速取腦，4℃、PBS 溶液清洗，去除殘余血液，取適量腦組織置于-80℃冰箱備用。用10%甲醛溶液固定剩余腦組織，用于制作組織切片。

1.2.3 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色觀察大鼠腦組織病理學變化取適量腦組織，梯度乙醇脫水處理，透明劑（二甲苯）處理后包埋至蠟塊中，冷凍后切成約4 μm 厚切片。組織脫蠟、水化后，蘇木精染色5～8 min，70%乙醇1 min，2%碳酸氫鈉返藍5～10 s，二甲苯透明處理2 min，最后以中性樹膠封片。封片后置于光鏡下觀察腦組織病理學變化。

1.2.4 免疫組織化學染色檢測大鼠腦組織凋亡因子、炎癥因子取1.2.3 中組織切片置于40℃水浴鍋中攤片，60℃烤箱烤片3 h 后脫蠟處理。采用微波對脫蠟水化的組織切片進行抗原修復，滴加3%過氧化氫溶液，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的影響。使用免疫組織化學筆在組織周圍畫圈，滴加合適濃度的山羊血清予以封閉。依次加一抗、酶標二抗、顯色劑，蘇木精復染后脫水、風干后切片，以中性樹膠進行封片，并于顯微鏡下觀察切片并拍照。結(jié)果判定標準：相同光強度下，400 倍顯微鏡下各個切片隨機挑選5 個互不重疊的視野，細胞內(nèi)有棕黃色顆粒即為陽性。

1.2.5 TUNEL 法檢測大鼠腦組織細胞凋亡取1.2.3 中組織切片貼附在多聚賴氨酸預處理后的載玻片上，確保切片的平整且不重疊。將切片置于62℃溫箱中烤片12 h，組織切片脫蠟、水化，二甲苯溶液沖洗玻片2 次，3 min/次；無水乙醇沖洗玻片2 次，3 min/次；95%和75%乙醇溶液分別清洗1 次，3 min/次；蒸餾水清洗2 次，5 min/次；PBS 洗2 次，5 min/次；37℃條件下20 μg/mL 蛋白酶K 溶液消化15 min，去除組織蛋白；蒸餾水沖洗4 次，2 min/次。將含2%過氧化氫的PBS 溶液加入色缸中，室溫條件下反應(yīng)5 min，PBS 沖洗2 次，5 min/次，使用濾紙將組織周圍水分吸干后，即刻在切片上滴加約50 μL TUNEL 反應(yīng)液，置于37℃濕盒中孵育1 h。PBS 液沖洗3 次，3 min/次，將切片周圍水分甩干后，滴加50 μL 辣根過氧化酶抗體至切片上，置于37℃溫箱中孵育30 min。蘇木精復染，PBS 液沖洗3 次，3 min/次，甩干水分，將2 滴DAB 溶液滴加在各組織切片上，室溫條件下顯色3～6 min。PBS 液沖洗3 次，3 min/次，二甲苯脫水，以中性樹膠封片、干燥。結(jié)果判定標準：細胞核呈棕色為細胞凋亡陽性；細胞核染藍色為未發(fā)生凋亡。在400 倍顯微鏡下，通過雙盲法對每個視野中的陽性細胞進行計數(shù)。

1.2.6 Western blotting檢測大鼠心肌組織p-AMPK/t-AMPK、LC3Ⅰ/Ⅱ及P62蛋白的表達將大鼠左心室心尖部組織約300 mg 剪碎后置于勻漿機，依次加入裂解液、蛋白酶及磷酸酶抑制劑，低溫條件下，在超聲細胞破碎儀中進行3 次裂解，裂解后靜置30 min，移入EP 管進行離心，將上清液分裝至1.5 mL離心管中，保存于低溫冰箱。上述所有操作需在冰面進行，用BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，并將其稀釋至相同濃度。將緩沖液倒入樣品中并完全混勻，95℃煮5 min，待蛋白質(zhì)全部變性后轉(zhuǎn)移至低溫冰箱。采用BCA 試劑盒檢測蛋白樣品含量，并通過裂解液將其調(diào)至相同濃度，在97℃金屬浴條件下持續(xù)加熱5 min。每個樣品提取20 μg 蛋白置于12%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，分離蛋白。電泳結(jié)束后，切取目的條帶，并將其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗p-AMPK、一抗LC3、一抗P62、內(nèi)參GAPDH，4℃一抗孵育過夜。TBST 溶液漂洗3 次后加入二抗搖床，孵育120 min。采用ECL 試劑盒進行顯色，然后進行增強化學發(fā)光反應(yīng)，將工作液滴加在PVDF 膜上，反應(yīng)5 min 左右待出現(xiàn)明顯的熒光帶，用濾紙吸去剩下的底物液，蓋上保鮮膜，X 射線膠片壓片后分別放入顯影液、定影液，放置適宜時間后沖洗膠片。將膠片晾干，掃描，使用Image 軟件測定條帶灰度值，以目的條帶灰度值與GAPDH 灰度值比值表示蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦組織病理學變化

HE 染色結(jié)果顯示，NS 組皮層神經(jīng)元胞漿豐富，核圓，堿染后呈藍色，分布均勻且排列整齊；NIR 組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)受損，分布不均勻，胞漿空泡化，胞核固縮，堿染后呈淡紅色；NIPost 組細胞結(jié)構(gòu)基本恢復正常，大部分神經(jīng)元包膜完整，胞核清晰可見；NIPostI 組經(jīng)CTRP9 抑制劑LiCl 干預后，后處理的保護效應(yīng)消失。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理切片 （HE染色×400）

2.2 各組大鼠腦組織凋亡因子表達水平比較

NS 組、NIR 組、NIPost 組、NIPostI 組Bax 和Bcl-2表達水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=2.368 和2.135，P=0.003 和0.005）。進一步兩兩比較結(jié)果：NIR 組、NIPost 組及NIPostI 組Bax 表達水平高于NS 組（P＜0.05），Bcl-2 表達水平低于NS 組（P＜0.05）；NIPost 組較NIR 組Bax 表達水平降低（P＜0.05），Bcl-2 表達水平升高（P＜0.05）；NIPostI 組較NIPost 組Bax 表達水平升高（P＜0.05），Bcl-2 表達水平降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腦組織Bax和Bcl-2表達水平比較（n=10，±s）

表1 各組大鼠腦組織Bax和Bcl-2表達水平比較（n=10，±s）

注：①與NS 組比較，P ＜0.05；②與NIR 組比較，P ＜0.05；③與NIPost組比較，P ＜0.05。

Bcl-2 14.48±0.63 5.45±0.51①11.96±0.62①②6.34±0.76①②③2.135 0.005組別NS組NIR組NIPost組NIPostI組F 值P 值Bax 4.91±0.44 12.51±0.73①7.55±0.46①②11.33±0.75①②③2.368 0.003

2.3 各組大鼠腦組織炎癥因子表達水平比較

NS 組、NIR 組、NIPost 組、NIPostI 組IL-6、IL-8 和IL-10表達水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=2.123、2.671 和2.935，P=0.011、0.002 和0.001）。進一步兩兩比較結(jié)果：NIR 組、NIPost 組及NIPostI 組IL-6、IL-8表達水平高于NS組（P＜0.05），IL-10表達水平低于NS 組（P＜0.05）；NIPost 組較NIR 組IL-6、IL-8表達水平降低（P＜0.05），IL-10 表達水平升高（P＜0.05）；NIPostI 組較NIPost 組IL-6、IL-8 表達水平升高（P＜0.05），IL-10表達水平降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腦組織IL-6、IL-8及IL-10表達水平比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠腦組織IL-6、IL-8及IL-10表達水平比較（n=10，±s）

注：①與NS 組比較，P ＜0.05；②與NIR 組比較，P ＜0.05；③與NIPost組比較，P ＜0.05。

IL-10 14.96±0.67 5.12±0.54①12.45±0.64①②6.28±0.55①②③2.935 0.001組別NS組NIR組NIPost組NIPostI組F 值P 值IL-6 5.41±0.43 13.91±0.85①8.31±0.74①②13.15±0.66①②③2.123 0.011 IL-8 6.16±0.54 14.83±0.63①9.12±0.56①②13.91±0.63①②③2.671 0.002

2.4 各組大鼠腦組織細胞凋亡情況

NS 組、NIR 組、NIPost 組、NIPostI 組凋亡細胞數(shù)分別為（55.41±6.43）個/HP、（213.91±20.85）個/HP、（138.31±15.74）個/HP、（163.15±10.66）個/HP，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=2.813，P=0.001）。進一步兩兩比較結(jié)果：NIR 組、NIPost 組和NIPostI 組凋亡細胞多于NS 組（P＜0.05）；NIPost 組和NIPostI 組較NIR 組凋亡細胞減少（P＜0.05）。NIPost 組和NIPostI組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織細胞凋亡情況 （TUNEL染色×400）

2.5 各組大鼠心肌組織p-AMPK/t-AMPK、LC3Ⅰ/Ⅱ及P62蛋白相對表達量比較

NS 組、NIR 組、NIPost 組、NIPostI 組p-AMPK/t-AMPK、LC3Ⅰ/Ⅱ及P62 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=2.203、2.772 和2.901，P=0.004、0.002 和0.001）。進一步兩兩比較結(jié)果：NIR 組、NIPost 組及NIPostI 組p-AMPK/t-AMPK蛋白相對表達量低于NS 組（P＜0.05），LC3Ⅰ/Ⅱ和P62 蛋白相對表達量高于NS 組（P＜0.05）；NIPost 組較NIR 組p-AMPK/t-AMPK 蛋白相對表達量升高（P＜0.05），LC3Ⅰ/Ⅱ和P62 蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；NIPostI 組較NIPost 組p-AMPK/t-AMPK 蛋白相對表達量降低（P＜0.05），LC3Ⅰ/Ⅱ和P62 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。見表3 和圖3～5。

圖3 各組大鼠心肌組織p-AMPK/t-AMPK蛋白的表達

表3 各組大鼠心肌組織p-AMPK/t-AMPK、LC3Ⅰ/Ⅱ及P62蛋白相對表達量比較 （n=10，±s）

表3 各組大鼠心肌組織p-AMPK/t-AMPK、LC3Ⅰ/Ⅱ及P62蛋白相對表達量比較 （n=10，±s）

注：①與NS 組比較，P ＜0.05；②與NIR 組比較，P ＜0.05；③與NIPost組比較，P ＜0.05。

P62 0.86±0.07 1.32±0.07①0.95±0.04①②1.08±0.05①②③2.901 0.001組別NS組NIR組NIPost組NIPostI組F 值P 值p-AMPK/t-AMPK 1.41±0.23 0.61±0.05①0.91±0.04①②0.75±0.06①②③2.203 0.004 LC3Ⅰ/Ⅱ0.56±0.04 1.03±0.03①0.72±0.06①②0.91±0.03①②③2.772 0.002

圖4 各組大鼠心肌組織LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白的表達

圖5 各組大鼠心肌組織P62蛋白的表達

3 討論

臨床上，及時恢復患者的氧合和血流灌注是搶救缺血再灌注損傷的基礎(chǔ)。一旦臟器發(fā)生缺血再灌注，所造成的損害將較先前更嚴重，且更持久，甚至可直接危及心、肺、腦等重要臟器。有研究結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷與氧自由基產(chǎn)生、促凋亡因子過表達、細胞內(nèi)鈣超載及炎癥反應(yīng)的級聯(lián)效應(yīng)等密切相關(guān)，但具體機制尚未明確[10-11]。1986年，MURRY等[5]首次觀察到心肌在經(jīng)歷一次或反復數(shù)次短暫缺血后，可在后續(xù)較長時間缺血中得到保護，對缺血的耐受性會明顯提高，并基于此提出了缺血預處理的概念。目前，大量臨床證據(jù)表明，缺血預處理對心肌損傷有保護作用[12-14]。

肥胖導致的脂肪細胞因子失去平衡是心血管疾病的重要誘因。CTRPs 是一類新發(fā)現(xiàn)的脂肪組織源性細胞因子，其分子結(jié)構(gòu)與脂聯(lián)素相似，共包含15 個成員，除CTRP4 外，其他成員均由氨基末端的信號肽、膠原樣結(jié)構(gòu)域、短的可變結(jié)構(gòu)域及羧基末端與補體成分C1q 同源的球狀結(jié)構(gòu)域等4 個不同結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[15-16]。李浩等[17]發(fā)現(xiàn)，CTRP9 在大鼠心肌缺血再灌注損傷的脂肪組織及血漿中表達水平明顯下降，脂肪組織NADPH 氧化酶和血漿游離脂肪酸含量明顯增加，且3T3-L1 脂肪細胞經(jīng)過氧化氫或如軟脂酸處理后，CTRP9 水平明顯降低，表明心肌缺血性損傷可促進脂肪組織氧化應(yīng)激，從而降低CTRP9 表達水平。本研究中，HE 染色結(jié)果再次驗證缺血預處理可對腦損傷發(fā)揮保護作用，且CTRP9 抑制劑干擾可抑制后處理的保護效應(yīng)。

缺血再灌注損傷是一種炎癥反應(yīng)過程，其病理生理作用包括補體激活、自由基生成、炎癥因子產(chǎn)生、細胞凋亡等[18]。本研究通過免疫組織化學和TUNEL 檢測結(jié)果證明心肌缺血再灌注可導致炎癥反應(yīng)級聯(lián)效應(yīng)和凋亡因子過表達，不僅可導致心臟衰竭，同時還會對其他臟器造成不良影響，其中腦組織受到的影響最大，嚴重的腦損傷會大幅度降低患者的生活質(zhì)量。此外，后處理可有效減輕心肌缺血再灌注所致炎癥反應(yīng)和凋亡因子過表達，CTRP9可通過激活AMPK，抑制心肌細胞凋亡，發(fā)揮心肌保護作用，與NIEMANN等[19]的結(jié)論基本一致。

AMPK 是一類異源性的三聚體的蛋白激酶，具有調(diào)節(jié)物質(zhì)能量代謝的作用。運動、AMP/ATP比例升高、缺血低氧及促炎因子等均可促進AMPK 磷酸化[20]。激活狀態(tài)的AMKP 可通過多種途徑參與能量合成、代謝，且對炎癥反應(yīng)具有抑制作用，可減輕機體氧化應(yīng)激損傷[21]。AMPK 信號通路受損與肥胖、糖尿病及心血管疾病關(guān)系密切。心肌缺血時，心肌組織AMP 含量升高，AMP/ATP 比值升高可激活AMPK，促使AMPK 磷酸化，進而激活下游信號分子，引發(fā)相應(yīng)的生物學效應(yīng)。AMPK 激活可加快心肌細胞攝取、利用葡萄糖的速度，改善能量供應(yīng)[22]。本研究中Western blotting 檢測結(jié)果表明，AMPK 信號通路調(diào)節(jié)CTRP9 后處理的心肌保護作用，給予CTRP9 抑制劑干預可抑制該保護作用。CTRP9 抑制劑處理后，再灌注后的溶酶體功能損傷標志性蛋白P62 和自噬體標志性蛋白LC3 相對表達量升高，表明CTRP9 后處理可促進再灌注后的自噬流恢復，進而保護心肌缺血再灌注損傷，與覃琴等[22]的研究結(jié)果大致相同。

綜上所述，CTRP9 對大鼠心肌缺血再灌注損傷有一定的保護作用，其可能通過激活AMPK 信號通路發(fā)揮作用，使AMPK 磷酸化來促進自噬體與溶酶體結(jié)合，加速自噬達到消化降解代謝產(chǎn)物再循環(huán)利用的效果，以此來發(fā)揮保護心肌缺血再灌注損傷的作用。缺血預處理時可通過調(diào)高CTRP9 水平來降低缺血再灌注損傷；應(yīng)用CTRP9 抑制劑后，其保護作用將受到抑制。