熊莉娟，賈 菠，劉 歡，周銀平，萬筱榮，劉永泉

(1.江西省職業(yè)病防治研究院，南昌 330006；2.江西省實驗動物重點實驗室，南昌 330006)

高效、低毒一直是國內(nèi)外農(nóng)藥發(fā)展的目標，但由于各種因素的影響，農(nóng)藥在保障農(nóng)業(yè)和林業(yè)生產(chǎn)的同時也會給人類健康帶來一定的損害[1]。我國農(nóng)藥依據(jù)《農(nóng)藥登記管理辦法》實行登記管理，農(nóng)藥登記必須提交農(nóng)藥的毒理學試驗報告。為農(nóng)藥登記而進行的毒理學試驗在國標《農(nóng)藥登記毒理學試驗方法》中共分為28部分，其中皮膚變態(tài)反應(致敏)試驗為第9部分。皮膚變態(tài)反應試驗的目的是檢測農(nóng)藥是否會引起人產(chǎn)生瘙癢等免疫源性皮膚反應[2]。評估農(nóng)藥皮膚致敏性的方法在國標中推薦的是局部封閉涂皮試驗(BT)、豚鼠最大值試驗(GMPT)和小鼠局部淋巴結(jié)分析試驗(LLNA)。BT法和GPMT法的不足是使用動物數(shù)量多，試驗時間長，結(jié)果依靠主觀判定。LLNA法使用動物數(shù)量減少，小鼠替代豚鼠，試驗時間縮短，結(jié)果更加客觀，但存在放射安全和環(huán)境污染等問題，為推廣應用帶來困難[3]。LLNA∶BrdU-ELISA法是在細胞增生過程中將溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)摻入細胞DNA中，用ELISA方法測定淋巴細胞中BrdU的量[4]。LLNA∶BrdU-ELISA法解決了放射性物質(zhì)的污染問題，且試驗周期短，操作相對簡單，檢測靈敏度高[5]，已被廣泛應用于檢測化妝品、化學品等各種試驗[6-9]，但在農(nóng)藥檢測方面未見系統(tǒng)的比較研究報道。本試驗旨在對比LLNA∶BrdU-ELISA法和經(jīng)典的封閉涂皮試驗對受試物致敏性判斷的能力，以探討該方法替代封閉涂皮試驗用于農(nóng)藥致敏性檢測的可行性和準確性。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

8~10周齡的Balb/c小鼠，雌性，SPF級，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，試驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘) 2019-0004。體重250~300 g的Hartley豚鼠，普通級，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，試驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘) 2019-0015。小鼠和豚鼠分別飼養(yǎng)于江西省職業(yè)病防治研究院屏障系統(tǒng)動物房和普通動物房，試驗動物使用許可證號：SYXK(贛) 2018-0006，溫度20~ 25 ℃，濕度52 %~60 %。動物試驗通過試驗動物倫理委員會審查。

1.2 受試物

2,4-二硝基氯苯(DNCB)(上?；瘜W三廠)，用丙酮/橄欖油AOO (sigma，Torres Y Ribelles S.A.)(體積比4∶1)配制成0.1% (質(zhì)量體積比)濃度；己基肉桂醛(HCA)用AOO配制成25% (體積比)濃度，異丙醇、水楊酸甲酯和乳酸均用AOO配制成50% (體積比)濃度，以上4種化學物均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。5種農(nóng)藥為農(nóng)藥生產(chǎn)單位送檢樣品，標識齊全，分別為：5%阿維菌素乳油(青島正道藥業(yè)有限公司)、450 g/L咪鮮胺水乳劑(青島金正農(nóng)藥有限公司)、40%噁草酮懸浮劑(青島瀚生生物科技股份有限公司)、1.2%辛菌胺水劑(濟南賽普實業(yè)有限公司)和250 g/L吡唑醚菌酯乳油(福建省德盛生物工程有限責任公司)。

1.3 主要儀器和試劑

AR224CN分析天平[奧康斯儀器(常州)有限公司]；ELX800酶標儀(美國BioTek公司)；R550IE多通道動物氣體麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；游標卡尺、細胞篩網(wǎng)、PBS液(北京索萊寶公司)；BrdU粉劑、BrdU-ELISA試劑盒(Roche公司)。

1.4 LLNA∶BrdU-ELISA(BALB/c)法

動物飼養(yǎng)1周后隨機分組(4只/組)，設受試物組、AOO組和蒸餾水組。在試驗第1、2、3 d在小鼠雙耳背部分別涂抹受試物、AOO溶液和蒸餾水25 μL，涂抹前用游標卡尺測量耳厚度。試驗第5 d每只小鼠腹腔注射BrdU標記液0.5 mL；注射后24 h采用七氟烷麻醉處死小鼠，測量耳厚度，取雙側(cè)耳后淋巴結(jié)稱重后用玻璃勻漿器研磨。200目過篩后用PBS液重懸，將每只小鼠的淋巴細胞懸液定容至15 mL。

將100 μL淋巴細胞懸液加入到96孔板中，每只小鼠3個平行孔，1 200 r/min離心10 min。經(jīng)試劑盒處理后用酶標儀檢測吸光度(A)值(發(fā)射波長和 參考波長分別為370 nm、492 nm)。

BrdU標記指數(shù)=(As370-Ak370)-(As492-Ak492) 式中：As370為受試物組在370 nm波長的吸光度；As492為受試物組在492 nm波長的吸光度；Ak370為空白組在370 nm波長的吸光度；Ak492為空白組在492 nm波長的吸光度。

按照下列公式計算刺激指數(shù)(stimulation index，SI)，SI＜1.6為致敏陰性，SI≥1.6為致敏陽性。

1.5 豚鼠局部封閉涂皮試驗方法

豚鼠試驗分為10組，每組13只。2,4-二硝基氯苯組的誘導濃度為1.0%，激發(fā)濃度為0.5%；25%己基肉桂醛組的誘導濃度為25%，激發(fā)濃度為12.5%；乳酸、異丙醇和水楊酸甲酯的誘導濃度均為50%，激發(fā)濃度均為25%；1.2%辛菌胺水劑、250 g/L吡唑醚菌酯乳油、450 g/L咪鮮胺水乳劑、40%噁草酮懸浮劑以及5%阿維菌素乳油的誘導濃度為原樣0.1 mL，激發(fā)濃度依據(jù)預試驗結(jié)果定為原樣1∶1蒸餾水稀釋液0.1 mL，為不引起皮膚刺激的最高劑量；陰性對照組僅給予激發(fā)試驗。

依據(jù)國標GB/T 15670.9—2017進行局部封閉涂皮試驗，觀察并記錄激發(fā)接觸后24 h、48 h和12 d的皮膚反應。按照局部封閉涂皮法的皮膚反應評分表進行評分，將試驗組出現(xiàn)皮膚紅斑或水腫(不論程度輕重)的動物數(shù)減陰性對照組出現(xiàn)皮膚紅斑或水腫(不論程度輕重)的動物數(shù)所得的差除以動物總數(shù)，計算每組動物的致敏率并判定受試物的致敏強度。

1.6 LLNA∶BrdU-ELISA結(jié)果與傳統(tǒng)試驗數(shù)據(jù)的比較

將5種化學物和5種農(nóng)藥LLNA∶BrdU-ELISA法BALB/c小鼠的致敏性檢測結(jié)果與豚鼠局部封閉涂皮試驗檢測結(jié)果及LLNA∶BrdU-ELISA法CBA小鼠文獻數(shù)據(jù)比較。

1.7 統(tǒng)計分析方法

用SPSS 25.0對LLNA∶BrdU-ELISA法的試驗結(jié)果進行分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVE)對耳厚差、淋巴結(jié)濕質(zhì)量和BrdU標記指數(shù)等進行統(tǒng)計分析。如果差異有統(tǒng)計學意義，則進一步用Dunnett’s T3檢驗法對受試組與對照組進行兩兩比較。檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 LLNA∶BrdU-ELISA(BALB/c)法的試驗結(jié)果

0.1% 2,4-二硝基氯苯和25%己基肉桂醛的淋巴結(jié)濕質(zhì)量以及BrdU標記指數(shù)有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。0.1% 2,4-二硝基氯苯、25%己基肉桂醛、50%乳酸、5%阿維菌素乳油、1.2%辛菌胺水劑和250 g/L吡唑醚菌酯乳油的耳厚差差異均有統(tǒng)計學意義(*P＜0.05，**P＜0.01)。0.1% 2,4-二硝基氯苯、25%己基肉桂醛和50%乳酸的SI均大于1.6。結(jié)果見表1。

表1 5種化學物和5種農(nóng)藥LLNA∶BrdU-ELISA(BALB/c)法檢測結(jié)果

續(xù)表1

2.2 LLNA∶BrdU-ELISA(BALB/c)結(jié)果與文獻數(shù)據(jù)比較

相關(guān)文獻中[10]異丙醇LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法與BT法均為致敏陰性，與本研究結(jié)果一致，但文獻中異丙醇LLNA∶BrdU-ELISA (CBA)法存在致敏假陽性結(jié)果。乳酸BT法試驗結(jié)果為致敏陰性，而LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法和LLNA∶BrdU-ELISA (CBA)法小鼠結(jié)果[10]均有假陽性結(jié)果產(chǎn)生。其他化學物和農(nóng)藥的LLNA∶BrdU- ELISA (BALB/c)法與BT法結(jié)果均一致。結(jié)果見表2。

表2 5種化學物和5種農(nóng)藥LLNA∶BrdU-ELISA(BALB/c)法與BT法致敏性檢測結(jié)果與文獻數(shù)據(jù)的比較

3 討 論

OECD指南TG442B推薦CBA小鼠，但該品系小鼠在國內(nèi)使用量較少，繁殖周期較長，價格較高，不易推廣應用；國內(nèi)外有不少學者進行了研究證實BALB/c小鼠是替代CBA小鼠的較好選擇，在國內(nèi)應用較為廣泛，遺傳背景明確穩(wěn)定[11-14]。本研究選取了5種化學物和5種農(nóng)藥，采用LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法對其致敏性進行評價。在本試驗條件下，LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法中0.1% 2,4-二硝基氯苯、25%己基肉桂醛和乳酸為致敏陽性，異丙醇、水楊酸甲酯、5%阿維菌素乳油、1.2%辛菌胺水劑、250 g/L吡唑醚菌酯乳油、450 g/L咪鮮胺水乳劑和40%噁草酮懸浮劑為致敏陰性。就“是或否”具有致敏性的判斷來說，90% (9/10)的受試物判斷結(jié)果一致，可以認為LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法和BT法對農(nóng)藥致敏性判斷能力沒有差異。由于受試物數(shù)量有限，故只能保守地認為LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法具有判斷農(nóng)藥致敏性的潛能，是否可行還需要進行更大樣本量的驗證。

由于刺激物和致敏物均可對淋巴細胞產(chǎn)生增殖作用，會致使LLNA產(chǎn)生假陽性[15]，OECD指導原則TG442B中規(guī)定試驗要觀察給藥動物的耳部紅斑和耳厚度，一旦給藥組動物耳厚度較對照組增加到25%以上，或紅斑評分≥3，應下調(diào)給藥濃度[16]。目前有研究通過增選刺激性指標(耳廓質(zhì)量、耳厚差)對化學物的刺激性和致敏性進行全面評價[17-18]。本研究中通過耳厚差評價受試物的刺激性，5%阿維菌素乳油、1.2%辛菌胺水劑和250g/L吡唑醚菌酯乳油的耳厚差差異均有統(tǒng)計學意義。查閱本研究室相關(guān)急性皮膚刺激試驗記錄：5%阿維菌素乳油的刺激強度為中等刺激性，1.2%辛菌胺水劑和250 g/L吡唑醚菌酯乳油的刺激強度為輕度刺激性，表明耳厚差能對農(nóng)藥的急性皮膚刺激性進行初步判定。

農(nóng)藥可分為單劑和混劑，根據(jù)中國農(nóng)藥信息網(wǎng)的數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)統(tǒng)計截至2022年6月13日)，在登記有效期內(nèi)的農(nóng)藥單劑數(shù)占總登記農(nóng)藥數(shù)的69%。本研究結(jié)果表明LLNA∶BrdU-ELISA (BALB/c)法具有判斷農(nóng)藥單劑的致敏性的潛能，但其能否運用于判斷農(nóng)藥混劑的致敏性還需進一步研究。