周小雙 賴斌

1.上饒市人民醫(yī)院普外科，江西上饒 334000；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院胃腸外科，江西南昌 330006

在中國，胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，近年來，由于針對胃癌相關(guān)篩查工作的開展、人們體檢意識的增強(qiáng)及相關(guān)危險(xiǎn)因素的控制，胃癌整體發(fā)生率和病死率有一定程度的下降，但我國人口基數(shù)龐大，胃癌疾病負(fù)擔(dān)依然十分嚴(yán)重。胃癌是來源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是胃部最常見的惡性腫瘤之一。研究表明腫瘤的形成是細(xì)胞生長、增生調(diào)控發(fā)生紊亂的結(jié)果，針對信號通路參與調(diào)控細(xì)胞生長與增生在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)之一。安俊平等研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3–kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）信號通路的激活可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增生、抑制凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向DNA合成期及有絲分裂期轉(zhuǎn)化，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。目前以PI3K/Akt 信號通路關(guān)鍵分子為靶點(diǎn)的腫瘤靶向治療正在蓬勃發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光法探討PI3K/Akt 信號通路相關(guān)蛋白磷酸化PI3K（phosphorylated phosphoinositide 3–kinase，p–PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p–Akt）在胃癌細(xì)胞及正常細(xì)胞中表達(dá)的差異，分析PI3K/Akt 信號通路在胃癌發(fā)生與發(fā)展中的作用，旨在為胃癌的早期診斷、預(yù)防和治療提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017 年1 月至2018 年12 月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院經(jīng)胃鏡病理確診為胃癌并行手術(shù)切除患者的胃癌標(biāo)本100 例，同時(shí)取對應(yīng)癌旁組織（距離腫瘤切緣5cm）共計(jì)100 例，所有患者既往均無放、化療及腹部手術(shù)史；術(shù)后病理明確診斷為胃癌。其中男61 例，女39 例；年齡35～78 歲，中位年齡63歲；根據(jù)最新版胃癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期9 例，Ⅱ期33 例，Ⅲ期51 例，Ⅳ期7 例；分化程度：低分化41 例，中分化46 例，高分化13 例；浸潤深度：病灶穿透漿膜63 例，未穿透37 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28 例。同時(shí)取48 例胃鏡檢查正常者的胃黏膜組織，其中男26例，女22 例，年齡31～68 歲，中位年齡58 歲。胃癌患者與檢查正常者的年齡和性別比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。本研究經(jīng)南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：研臨審2018 第105號），全部患者均簽署知情同意書。

1.2 主要方法與試劑

所有標(biāo)本離體后進(jìn)行甲醛固定并石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，用免疫組織化學(xué)SP 法檢測p–PI3K、p–Akt在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況。兔抗人p–PI3K 購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗人p–Akt、DAB 顯色劑及免疫組織化學(xué)SP 試劑盒購自中國武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 結(jié)果判讀

試驗(yàn)采取雙盲法，由兩位試驗(yàn)參與者對染色結(jié)果進(jìn)行判讀，以視野中組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，p–PI3K 表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，p–Akt 主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，部分表達(dá)于細(xì)胞核，根據(jù)染色程度分為無染色、淺黃色、棕黃色、黃褐色，分別代表0～3 分，得分計(jì)為a。根據(jù)視野內(nèi)陽性細(xì)胞所占比例分為≤10%、>10%～25%、>25%～50%、>50%，分別代表0～3 分，得分計(jì)為b。最終評分=a×b，取兩位試驗(yàn)人員評分的平均值為最終評分，最終評分≥3 分為陽性，<3 分為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。收集PI3K/Akt 信號通路中相關(guān)蛋白p–PI3K 和p–Akt 在胃癌組織、癌旁組織和正常胃黏膜中表達(dá)的相關(guān)數(shù)據(jù)，采用檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p-PI3K、p-Akt 在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜中的表達(dá)差異

試驗(yàn)結(jié)果顯示，p–PI3K、p–Akt 陽性表達(dá)的細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯黃色、棕黃色顆粒，p–PI3K 在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜中的陽性表達(dá)率分別為55.0%、23.0%及14.6%；p–Akt 在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜中的陽性率分別為29.0%、13.0%及8.3%，胃癌組織中p–PI3K、p–Akt 的表達(dá)率顯著高于癌旁組織及正常胃黏膜（<0.05），見圖1、表1。

表1 胃癌組織、癌旁組織、正常胃黏膜中p-PI3K、p-Akt 的表達(dá)差異（例）

圖1 胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜細(xì)胞的p-PI3K、p-Akt 的表達(dá)差異（SP 法染色）

2.2 p-PI3K、p-Akt 的表達(dá)與胃癌相關(guān)病理參數(shù)之間的關(guān)系

試驗(yàn)結(jié)果顯示，胃癌組織中p–PI3K、p–Akt 的表達(dá)與患者的年齡、性別無明顯相關(guān)性（>0.05），腫瘤病理分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、浸潤深度穿透漿膜及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者胃癌組織中p–PI3K、p–Akt的陽性率更高（<0.05），見表2。

表2 p-PI3K、p-Akt 的表達(dá)與胃癌相關(guān)病理參數(shù)之間的關(guān)系（例）

3 討論

腫瘤的形成是基于細(xì)胞增生、分化失控的復(fù)雜過程，本研究中的PI3K/Akt 信號通路作為細(xì)胞中重要的信號通路之一，可通過激活眾多下游效應(yīng)分子，從而抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增生、加速腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，p–PI3K 在3 種組織細(xì)胞中的陽性率分別為55.0%、23.0%、14.6%；p–Akt 在3 種組織細(xì)胞中的陽性率分別為29.0%、13.0%、8.3%，兩種蛋白在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)陽性率均呈逐漸下降趨勢，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)通過比較不同臨床病理參數(shù)下胃癌組織細(xì)胞內(nèi)的p–PI3K、p–Akt 表達(dá)陽性率后發(fā)現(xiàn)，不同年齡、性別的患者，其胃癌組織中的p–PI3K、p–Akt 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但在腫瘤不同分化程度、浸潤深度、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)下，兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且從各項(xiàng)指標(biāo)綜合分析可以看出，分化程度越低、浸潤深度越深、病理分期越晚、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者兩種蛋白的表達(dá)陽性率更高。

綜合分析可以得出，PI3K/Akt 信號通路在胃黏膜細(xì)胞癌變過程中出現(xiàn)過度激活，激活后的信號通路在胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著積極作用。通過參與調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，PI3K/Akt 信號通路活化后可激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）；mTOR 促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin–dependent protein kinase，CDK）與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合，CDK 的活化可使細(xì)胞周期啟動，促進(jìn)細(xì)胞周期由G期轉(zhuǎn)換到S 期，縮短細(xì)胞周期，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。PI3K/Akt 通路活化后促進(jìn)凋亡蛋白與伴侶蛋白結(jié)合，從而抑制凋亡復(fù)合體的形成，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡；同時(shí)PI3K/Akt 通路活化后通過抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）家族中的caspase–9 的磷酸化而使之失活，進(jìn)一步抑制線粒體釋放抑制細(xì)胞色素C 等凋亡因子，抑制凋亡。PI3K/Akt 通路的激活可通過激活血管內(nèi)皮上的內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），從而在血管內(nèi)生成一氧化氮，協(xié)助調(diào)節(jié)血管功能，引起血管擴(kuò)張、血管重塑及血管的新生；同時(shí)上調(diào)血管表皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和其他血管生成因子，從而促進(jìn)腫瘤血管的生長。PI3K/Akt 通路激活后可激活基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprpteinase，MMP），MMP 是一種鋅離子依賴的蛋白水解酶超家族。在人體中，活化的MMP 幾乎可水解所有的細(xì)胞外基質(zhì)，腫瘤細(xì)胞周圍的細(xì)胞外基質(zhì)水解后，使腫瘤細(xì)胞更易脫離瘤體，從而轉(zhuǎn)移到人體其他部位，進(jìn)而使腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移加速。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌轉(zhuǎn)移的重要途徑，相關(guān)研究證實(shí)PI3K/Akt 信號通路活化后不僅可促進(jìn)腫瘤生長，同樣可促進(jìn)腫瘤微淋巴管的形成。Liu等研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt 通路的活化確實(shí)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，究其原因可能是活化的PI3K/Akt 通路使胃癌組織內(nèi)的微淋巴管密度增加，從而增加腫瘤細(xì)胞與淋巴系統(tǒng)的接觸面積，加速腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散。

隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt 信號通路的激活除了在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中起著重要作用外，在腫瘤的耐藥性進(jìn)程中也扮演著重要角色。研究證實(shí)在胃癌、乳腺癌及白血病等腫瘤中，PI3K/Akt 信號通路在化療耐藥的形成與維持中起著重要作用。另外，研究發(fā)現(xiàn)使用PI3K 抑制劑處理后的胃癌耐藥細(xì)胞對順鉑的敏感度增加，在黑色素瘤的研究中也發(fā)現(xiàn)PI3K 抑制劑可逆轉(zhuǎn)胰島素所引起的化療耐藥；而阻斷PI3K/Akt 信號通路可逆轉(zhuǎn)其耐藥，恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感度。

綜上所述，PI3K/Akt 信號通路中相關(guān)蛋白p–PI3K 和p–Akt 在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，同時(shí)隨著患者胃癌病情的進(jìn)展，兩種蛋白的表達(dá)陽性率也逐漸升高，因此，針對PI3K/Akt 通路的相關(guān)檢測及靶向藥物的應(yīng)用可作為臨床診斷及治療胃癌的一個(gè)新策略。