黃清松 ，韓雪峻 ，張宏亮 ，王申元 ，凌 宇 ，劉羿羿 ，劉春霞 ，張焱如 ，周歡敏 ，李 璐 ，曹俊偉

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)生物制造重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.上海祥欣畜禽有限公司，上海 200000；4.內(nèi)蒙古赤峰市元寶山區(qū)農(nóng)牧局，內(nèi)蒙古 赤峰 024076）

1 前言

目前生豬養(yǎng)殖業(yè)人工授精主要使用的是鮮精，凍精使用比例僅占1%左右。豬精液的低溫保存研究早在18世紀(jì)60年代就開始了，研究初期復(fù)蘇精子的活力僅達(dá)到30%，隨著研究的不斷進(jìn)行，20世紀(jì)初冷凍后復(fù)蘇豬精子活力可達(dá)到60%，但仍然達(dá)不到生產(chǎn)要求，無法應(yīng)用于商品豬養(yǎng)殖。20世紀(jì)70年代，我國開始以液氮作為冷凍源進(jìn)行精液冷凍保存的研究，20世紀(jì)90年代以后冷凍精液從顆粒型轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)管型。1977年，我國成立豬精液冷凍技術(shù)研究相關(guān)小組，對豬精液冷凍問題展開深入研究相關(guān)規(guī)范操作。由于豬每次射精量大，精子質(zhì)膜不飽和脂肪酸比例高等特殊的生物學(xué)特性，冷凍—解凍過程中容易受到損傷，與鮮精相比還具有很大差距。低溫保存精液用于人工授精后，母豬的受胎率、分娩率、窩產(chǎn)仔數(shù)均低于鮮精，其繁殖效果不盡人意。

國外許多研究報道，在精液稀釋液中添加其他物質(zhì)，如糖類、抗氧化類、蛋白類、維生素類等可對提高低溫保存精液品質(zhì)產(chǎn)生一定作用。國內(nèi)對于豬精子低溫保存主要集中在保護(hù)劑的探究和冷凍方法的研究。李青旺等、周佳勃等和李井春等均對冷凍保護(hù)劑、冷凍程序和不同精液稀釋液對豬精子活力的影響進(jìn)行了研究，其最終目的均為了提高凍精的品質(zhì)，擴(kuò)大凍精在人工授精中的使用比例，降低生豬養(yǎng)殖成本。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

本實驗的豬精液均來自位于陜西省榆林市的上海祥欣榆林公豬站，選取3頭優(yōu)質(zhì)杜洛克公豬，精子活力為70%以上的，精子形態(tài)正常的，精子密度為0.6×108/mL，于37.5℃條件下將精液運(yùn)輸?shù)綄嶒炇摇?/p>

2.2 實驗方法

2.2.1 0.5mL細(xì)管凍精制備與精液解凍

將樣品經(jīng)過篩選后混勻在一起，以消除個體間差異對實驗造成的影響，首先將樣品放入室溫下平衡1 h，接著放進(jìn)4℃環(huán)境緩慢降溫2 h，將470 uL降溫后的樣品小心注入0.5 mL細(xì)管中，使用配套的封口粉將注入樣品的細(xì)管封住，之后將細(xì)管置于液氮面上2 cm處熏蒸10 min，最后將熏蒸好的樣品投入到液氮中保存兩周。處理后的細(xì)管凍精將用于實驗組，鮮精用于對照組。解凍時，快速將充滿精液的細(xì)管從液氮中取出并投入到37 ℃水浴中緩慢震動，并觀察精液溶解情況，待精液完全溶解時，馬上取出細(xì)管，剪開兩端，取出精液并在室溫下800 g×離心5 min，去掉上清液。

2.2.2 豬精子質(zhì)膜完整率檢測

采用雙熒光染色流式細(xì)胞術(shù)對精子質(zhì)膜進(jìn)行檢測（B DTM，Annexin V-FITC，貨號C1062M）。將對照組和復(fù)蘇后的實驗組精子樣品分別收集到1.5 mL離心管中，800 g×離心5 min，將上清丟棄，用37 ℃預(yù)熱的PBS緩沖液將其分別稀釋，使精子細(xì)胞濃度為2×106～3×106/mL，用PBS緩沖液對樣品清洗兩次后，再使用Annenin V-FITC結(jié)合液對樣品重新懸浮，使精子細(xì)胞濃度為1×106～1.5×106/mL，取195 uL精子懸液，加入5 uLVF I T C充分混勻，室溫下孵育10 min，然后加入10 uL PI染色液充分混勻，室溫避光孵育15 min。利用N o v e C y t eTM型流式細(xì)胞儀（下同）檢測每個精子細(xì)胞的前向角散射（FSC）和側(cè)向角散射（SSC），使用波長為520 mm的帶過濾器檢測F I T C熒光信號（BL1），另一波長大于610 mm的帶過濾器檢測PI（BL3）。每份樣品至少檢測10 000個精子細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀自帶的軟件進(jìn)行分析。

2.2.3 豬精子頂體完整率檢測

采用異硫氰酸酯熒光標(biāo)記的花生凝集素（FITC-PNA）和碘化丙?。≒I）雙染法對豬精子進(jìn)行頂體完整率檢測。操作如下：（1）陰性對照：取200 uL稀釋好的樣品直接上機(jī)；（2）FITC-PNA單染：取200 uL稀釋好的樣品600 g×離心4 min，棄上清，加入190 uL PBS緩沖液再加入10 uL FITC-PNA染液，輕輕混勻避光37℃孵育20 min，孵育結(jié)束后上機(jī)；（3）PI單染：取200 uL稀釋好的樣品600 g×離心4 min，棄上清，加入190 uL PBS緩沖液再加入10 uL PI染液，輕輕混勻避光37℃孵育5 min，孵育結(jié)束后上機(jī)；（4）雙染：取200 uL稀釋好的樣品600 g×離心4 min，棄上清，加入180 uL PBS緩沖液再加入10 uL FITC-PNA染液，輕輕混勻避光37℃孵育20 min，孵育結(jié)束后加入10 uLPI染液，充分混勻避光37℃孵育5 min，孵育結(jié)束后直接上機(jī)；（5）流式細(xì)胞檢測：使用配備激發(fā)波長488 mm，應(yīng)用前向散射光（FSC）和側(cè)向散射光（SSC）設(shè)門后，綠色熒光采用BL1通道檢測，紅色熒光采用BL3檢測通道每份樣品至少檢測10 000個精子細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀自帶的軟件分析。

2.2.4 豬精子核DNA完整性檢測

采用流式細(xì)胞儀吖啶橙染色法檢測豬精子核完整性，分別將新鮮精子和凍融后的精子樣品收集到1.5 mL離心管中，800 g×離心5 min，將上清丟棄，用37℃預(yù)熱的TNE緩沖液將其分別稀釋，使精子樣品濃度調(diào)整至1×106～2×106/mL，取100 uL樣品加入200 uL酸液，充分混勻準(zhǔn)確計時30 s，之后加入600 uL吖啶橙染色液充分混勻，利用NoveCyteTM型流式細(xì)胞儀檢測每個精子細(xì)胞的前向角散射（FSC）和側(cè)向角散射（SSC），用一波長為520 mm的帶過濾器檢測FITC熒光信號（BL1），另一波長大于610 mm的帶過濾器檢測PI（BL3）。

2.2.5 豬精子抗氧化水平檢測

精子的抗氧化水平測定包括4部分，分別是：總抗氧（T-AOC）水平、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）含量。采用試劑盒對這4部分進(jìn)行測定，按照試劑盒說明書操作。

2.2.6 豬精子掃描和透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察

2.2.6.1 豬精子的掃描電鏡

1）樣品固定：取相同濃度、相同體積的鮮精和凍融后的凍精樣品，用PBS緩沖液洗滌3次，洗滌后加入一定量的電鏡固定液，4℃固定保存及運(yùn)輸。

2）后固定：使用0.1 M磷酸緩沖液（pH 7.4）將固定好的樣品漂洗3次，每次15 min。使用0.1 M磷酸緩沖液（pH 7.4）配制1%鋨酸溶液，室溫避光固定1～2 h。使用0.1 M磷酸緩沖液（pH 7.4）漂洗3次，每次15 min。

3）脫 水：樣 品 依 次 入30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%的100%無水乙醇中脫水，每次15 min，乙酸異戊酯15 min。

4）干燥：將樣本放入臨界干燥儀內(nèi)進(jìn)行干燥。

5）導(dǎo)電處理：將處理好的樣本緊貼于導(dǎo)電碳膜雙面膠上放入離子濺射儀，樣品進(jìn)行噴金30 s左右。

6）上機(jī)觀察：將處理好的樣品放入掃描電鏡樣品臺進(jìn)行觀察并進(jìn)行圖像采集。

2.2.6.2 豬精子的透射電鏡

1）樣品固定：取相同濃度、相同體積的鮮精和凍融后的凍精樣品，用PBS緩沖液洗滌3次，洗滌后加入一定量的電鏡固定液，4℃固定保存及運(yùn)輸。

2）后固定：使用0.1 M磷酸緩沖液（pH 7.4）配制1%鋨酸溶液，室溫避光固定2 h。0.1 M磷酸緩沖液（pH 7.4）漂洗3次，每次15 min。

3）室溫脫水：樣品依次入3 0%→5 0%→7 0%→8 0%→90%→95%→100%的100%無水乙醇上脫水，每次20 min，100%丙酮2次，每次15 min。

4）滲透包埋：將丙酮與812包埋劑按照1比1混勻，37℃ 2～4 h，丙酮與812包埋劑按照1比2混勻，37℃滲透過夜，純812包埋劑37℃ 5～8 h。將純812包埋劑倒入包埋板，將樣品插入包埋板后37℃烤箱過夜。

5）聚合：包埋板放于60℃烤箱聚合48 h，取出樹脂塊備用。

6）超薄切片：將銅網(wǎng)于2%醋酸鈾飽和無水乙醇溶液避光染色8 min，用70%無水乙醇清洗3次；將2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min；用超純水清洗3次，用濾紙稍吸干。將銅網(wǎng)切片放入銅網(wǎng)盒內(nèi)室溫干燥過夜。

7）在透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察，對采集到的圖像進(jìn)行分析。

2.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計整理，使用Graph pad Prism 8軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行配對樣本t檢驗分析差異顯著性并作圖顯示差異分析。P＞0.05用ns表示沒有統(tǒng)計學(xué)差異；P＜0.05用＊表示有統(tǒng)計學(xué)差異；P＜0.01用＊＊＊表示極顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 低溫保存對豬精子質(zhì)膜的影響

流式細(xì)胞儀Annenxin V—PI雙熒光染色法檢測豬精子質(zhì)膜完整率實驗結(jié)果如圖1所示。

由圖1顯示，在a區(qū)域，同對照組（99.24%）相比，實驗組活的完整精子數(shù)量（71.30%）大幅度下降，兩者差異顯著（P＜0.05）。同時實驗組D區(qū)域死亡破損的精子數(shù)量（23.53%）同對照組相比（0.10%）出現(xiàn)大幅度提升，兩者差異顯著。結(jié)果表明，低溫冷保存導(dǎo)致豬精子質(zhì)膜破裂，精子內(nèi)物質(zhì)流出，死亡精子數(shù)量增多。目前對于這種損傷還不清楚是低溫冷凍造成的還是冷凍后精子復(fù)蘇環(huán)節(jié)造成的。

圖1 流式細(xì)胞儀Annenxin V—PI雙熒光染色法檢測豬精子質(zhì)膜完整率(A圖對照組，B圖實驗組)

3.2 低溫保存對豬精子頂體的影響

如圖2所示，圖2A是對照組的流式散點圖，圖2B是實驗組的流式散點圖，同對照組（70.13%）相比，實驗組a區(qū)域活（11.33%）的頂體完整的精子數(shù)量大幅下降，兩者差異顯著（P＜0.05）。同時，低溫保存導(dǎo)致精子頂體破損的數(shù)量（b區(qū)域和c區(qū)域）大幅度上升，從對照組的15.83%升至實驗組的82.54%差異顯著（P＜0.05）。低溫冷凍保存對豬精子頂體破損嚴(yán)重，直接導(dǎo)致凍精在應(yīng)用到實際生產(chǎn)中豬受精率低下。

圖2 流式細(xì)胞儀FITC—PNA/PI雙熒光染色法檢測豬精子頂體完整率（A圖對照組，B圖實驗組）

3.3 低溫保存對豬精子核DNA完整性的影響

如圖3顯示，相比于對照組，低溫保存對精子的精子核完整率差異不顯著。Q2-1象限是正常精子區(qū)域；Q2-2是輕度DNA損傷的精子區(qū)域；Q2-4是重度DNA損傷的精子。通過對實驗組和對照組Q2-1區(qū)域數(shù)據(jù)比較，實驗組（94.33%）和對照組（96.29%）的精子核完整率差異不顯著（P＞0.05），這可能與精子核結(jié)構(gòu)有關(guān)。豬精子核是由魚精蛋白和DNA物質(zhì)組成的，可以進(jìn)行受精的成熟精子的精子核DNA是雙鏈結(jié)構(gòu)，魚精蛋白與DNA通過二硫鍵（S=S）緊密結(jié)合在一起，形成精子核獨特的致密結(jié)構(gòu)，使其具有更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，DNA物質(zhì)很難與核蛋白分離，這也使得DNA雙鏈結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。

圖3 流式細(xì)胞儀AO熒光染色法檢測豬精子核完整性的流式散點圖（A圖對照組，B圖實驗組）

3.4 低溫保存對豬精子抗氧化能力的影響

使用5種抗氧化試劑盒對豬精子樣品的各抗氧化水平進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4所示。同對照組相比，低溫保存導(dǎo)致豬精子的總抗氧能力（T-AOC）極顯著降低（P＜0.01），丙二醛（MDA）含量極顯著升高（P＜0.01），超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著降低（P＜0.05），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性顯著降低（P＜0.05）；低溫保存對豬精子過氧化氫酶（CAT）活性無顯著性影響（P＞0.05）。

圖4 對照組和實驗組豬精子的5個不同抗氧化值的柱狀圖

總抗氧化能力（T-AOC）是指抗氧化分子以及抗氧化酶組成的精子總抗氧化水平，反映精子細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)的整體狀態(tài)。精子細(xì)胞內(nèi)含有多種抗氧化酶，包括谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）等。SOD能夠催化活性氧生成過氧化氫，GSHPX可以催化還原型谷胱甘肽還原過氧化氫。低溫保存導(dǎo)致精子細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性降低，精子細(xì)胞內(nèi)有毒物質(zhì)含量升高。

3.5 低溫保存對豬精子超微結(jié)構(gòu)的影響

3.5.1 低溫保存對豬精子外部的影響

掃描電鏡主要是對精子細(xì)胞的外部情況進(jìn)行拍照分析，通過高分辨率電鏡對樣品表面變化拍照并且顯示出來，如圖5所示。

如圖5A顯示：對照組精子頭部整體圓滑，精子頭部上方頂體結(jié)構(gòu)與精子頭部質(zhì)膜連接緊密、邊界清晰、邊緣整齊、精子頭部表面無任何附著物，整體飽滿。如圖5B顯示:實驗組精子頭部呈現(xiàn)一種坍塌狀，精子頭部的頂體明顯破損，精子頂體整體呈現(xiàn)一種破損凹陷的狀態(tài)，精子頂體內(nèi)的相關(guān)頂體酶丟失；精子頭部外的質(zhì)膜整體呈現(xiàn)褶皺狀，質(zhì)膜粗糙并呈現(xiàn)泡狀，質(zhì)膜外附著一些蛋白物質(zhì)，這些附著物是精子在低溫保存時質(zhì)膜破損產(chǎn)生的物質(zhì)并附著在精子表面。

圖5 精子樣品的頭部掃描電鏡圖（A圖對照組,B圖實驗組）

精子樣品的頸部連接處和尾部中段的掃描電鏡圖如圖6所示。

如圖6A和圖6B顯示：對照組精子的頸部連接處連接緊密光滑，精子尾部中段外周致纖維顯示清晰，無附著物。如圖6C和圖6D顯示：實驗組精子頸部連接處出現(xiàn)明顯的外表面部分破損（圖6C），甚至整個頸部斷裂（圖6D），精子的尾部中段顯示外表面粗糙模糊，附著有其他物質(zhì)，外周纖維部分地方破損（圖6C）。

圖6 精子樣品的頸部連接處和尾部中段的掃描電鏡圖（A圖和B圖對照組，C圖和D圖實驗組）

3.5.2 低溫保存對豬精子內(nèi)部的影響

透射電鏡主要通過電子槍發(fā)射的電子束照射到樣品上，透過樣品的電子束將攜帶樣品內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息，通過高分辨率透射電鏡將精子樣品內(nèi)部細(xì)致的變化拍攝并顯示出來，如圖7所示。

如圖7A顯示：對照組精子的整個圖，基本上無模糊狀區(qū)域。如圖7B顯示：實驗組精子的整個圖上部分呈模糊狀。

圖7 精子樣品整體透射電鏡圖（A圖對照組，B圖實驗組）

精子樣品頭部透射電鏡圖如圖8所示。

如圖8A顯示：對照組精子頭部頂體與精子頭部結(jié)合明顯，頂體呈光滑的橢圓形，緊緊與頭部質(zhì)膜結(jié)合，頂體顏色深，頭部的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)完整清晰，無破損。如圖8B顯示：實驗組精子頂體外膜明顯呈囊泡狀，部分精子的頭部甚至頂體丟失，精子頭部外的質(zhì)膜也比較模糊，部分精子頭部外的質(zhì)膜呈破損狀，精子頂體外膜與精子頭部分離，部分精子頭部質(zhì)膜也呈現(xiàn)囊泡化。

圖8 精子頸部連接處透射電鏡圖（A圖對照組，B圖實驗組）

精子頸部連接處透射電鏡圖如圖9所示。

如圖9A顯示：對照組精子頸部連接處連接完好，無腫脹破裂。如圖9B顯示：實驗組精子精頸部連接處明顯腫脹，部分連接處破損。

圖9 精子頸部連接處透射電鏡圖（A圖對照組，B圖實驗組）

精子尾部中段透射電鏡圖如圖10所示。

如圖10A顯示：對照組精子尾部的9＋2結(jié)構(gòu)顯示清晰，尾部中段的9＋2結(jié)構(gòu)外的線粒體鞘呈基本圓形顯示清晰，分布均勻。如圖10B顯示：實驗組精子尾部的9＋2結(jié)構(gòu)顯示模糊，呈模糊狀，9＋2結(jié)構(gòu)外的線粒體鞘呈模糊的橢圓形，分布不均勻，部分線粒體腫脹。

圖10 精子尾部中段透射電鏡圖(A圖對照組，B圖實驗組)

精子尾部與9＋2結(jié)構(gòu)和線粒體鞘透射電鏡橫切圖如圖11所示。

如圖11顯示：對照組（A、B、C）精子尾部顯示清晰完好，無腫脹破裂，精子的9＋2結(jié)構(gòu)橫切面圖顯示清晰，內(nèi)部的微管分布均勻，精子尾部末端纖維鞘分布均勻光滑，微管外環(huán)抱的線粒體鞘顏色程度一致。實驗組（D、E、F）精子尾部線粒體鞘有明顯間隙，精子的9＋2結(jié)構(gòu)切面圖顯示模糊，有的微管之間連接在一起，部分出現(xiàn)紊亂，9＋2結(jié)構(gòu)外的線粒體鞘顯示模糊，分布不均勻，精子尾部末端纖維鞘蜷縮，纖維鞘之間分布不均勻。

圖11 精子尾部與9+2結(jié)構(gòu)和線粒體鞘透射電鏡橫切圖

4 結(jié)論

1）豬精子低溫保存復(fù)蘇后精子的質(zhì)量顯著降低，死亡精子數(shù)量顯著上升，精子活率顯著降低。精子抗氧化能力降低，其中精子總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性差異顯著。

2）冷凍-解凍后豬精子超微結(jié)構(gòu)受到一定的損傷，損傷主要表現(xiàn)在精子頂體外膜腫脹呈囊泡狀，頂體內(nèi)物質(zhì)流出，部分頂體完全脫落；精子質(zhì)膜腫脹破裂，精子頭部物質(zhì)流出；精子頸部連接處外膜破損，部分頸部連接處完全斷裂，造成精子頭部和尾部分離；精子尾部中段線粒體鞘模糊，分布不均勻，部分線粒體腫脹，甚至破損，精子尾部末端纖維鞘蜷縮，纖維鞘和外周致密纖維之間分布不均勻，貫穿于尾部9＋2結(jié)構(gòu)的微管紊亂。