馮袁輝，楊易辰，周子?jì)?，張麗萍，?鵬，任曉暄，陳俊陶，馬惠芳△

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.唐山市豐南區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，河北 唐山 063000；3.北京市朝陽區(qū)東風(fēng)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京 100025；4.北京市朝陽區(qū)望京社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京 100025)

腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome，IBS)是一種慢性的功能性胃腸疾病，伴隨著腸道習(xí)慣的改變而出現(xiàn)腹痛，IBS在全球的患病率約為10%～25%[1]，我國(guó)的IBS患病率約為5%～7%[2]。IBS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其病理生理學(xué)范圍廣泛，包括運(yùn)動(dòng)、內(nèi)臟感覺和心理社會(huì)困擾等異常[3]。研究表明IBS患者常伴有抑郁障礙[4]。而IBS患者伴隨的抑郁情緒可因胃腸道癥狀的緩解而隨之改善[5]。但I(xiàn)BS伴抑郁情緒作用機(jī)制尚不明確，仍需要進(jìn)一步探討。

Sirtuins蛋白家族(SIRT)是一類具有NAD+依賴性脫乙酰酶活性或 ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白，屬于第三類組蛋白去乙?；浮３聊畔⒄{(diào)節(jié)因子1(Silent information regulator 1，SIRT1)是研究最廣泛的sirtuin，存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中[6-7]。SIRT1不僅與IBS內(nèi)臟痛密切相關(guān)[8]，SIRT1缺失會(huì)抑制環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(c AMP-response element binding protein，CREB) mRNA的翻譯，從而下調(diào)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)[9-10]，影響海馬神經(jīng)元突觸的形態(tài)和功能，與抑郁情緒同樣密切相關(guān)。小鼠經(jīng)過慢性變化壓力(Chronic variable stress，CVS)后，給予SIRT1抑制劑會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)焦慮樣行為[11]。SIRT1信號(hào)通路的異?？赡苁荌BS伴抑郁狀態(tài)的病理基礎(chǔ)之一。因此，本實(shí)驗(yàn)電針“天樞”“上巨虛”，觀察其對(duì)IBS伴抑郁情緒大鼠胃腸癥狀和抑郁情緒的影響，并通過檢測(cè)結(jié)腸組織SIRT1和海馬組織中SIRT1、CREB及BDNF蛋白表達(dá)，探討針刺對(duì)IBS伴抑郁情緒的作用機(jī)制，為針灸治療IBS伴抑郁情緒的遠(yuǎn)端配穴提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)SD大鼠36只，8周齡，雄性，體質(zhì)量220～250 g，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)良鄉(xiāng)校區(qū)動(dòng)物房，飼養(yǎng)條件：光照周期12 h/12 h，光照 8：00—20：00，黑暗 20：00—8：00，室溫23 ℃，濕度(55±5)%，每日定時(shí)清潔通風(fēng)，每籠 3 只，動(dòng)物可自由活動(dòng)、進(jìn)食水。大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、電針組與西藥組。實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性喂養(yǎng) 7 d。實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處置遵循《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 試劑 二硝基苯磺酸(Dinitrobenzenesulfonic acid，上海晨易生物有限公司);毫針0.25 mm×13 mm(北京中研太和科技有限公司);直腸給藥管(7號(hào)，四川益泰醫(yī)療器械有限公司);匹維溴銨片(北京萬生藥業(yè)有限責(zé)任公司);重組Anti-SIRT1抗體(ab189494，英國(guó)abcam公司);重組Anti-CREB抗體(ab32515，英國(guó)abcam公司);重組Anti-BDNF抗體 (ab108319，英國(guó)abcam公司)。

1.2.2 儀器 電針儀(長(zhǎng)城牌KWD-808I，常州市武進(jìn)長(zhǎng)城醫(yī)療器械有限公司);包埋機(jī)(TB718，湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司);切片機(jī)(RM2235，德國(guó)Leica);組織脫水機(jī)(ST5020，德國(guó)Leica);顯微鏡(Olympus×51，日本Olympus公司)。

1.3 造模方法

造模方法選擇二硝基苯磺酸(DNBS)灌腸結(jié)合慢性束縛應(yīng)激方法，創(chuàng)建IBS伴抑郁情緒大鼠模型。

1.3.1 DNBS灌腸 除空白組外，第7天禁食24 h，用棉棒輕觸大鼠尾根部刺激排便，腹腔注射 7%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，滴有石蠟油的8 F 導(dǎo)尿管緩慢插入肛門8 cm，緩慢注入DNBS溶液(50 mg/kg，混入50%乙醇溶液1 mL中)于結(jié)腸，完成后保持大鼠頭低位3 min，避免從肛門回流?？瞻捉M用等體積0.9%生理鹽水灌腸，灌腸操作與造模組方法相同，常規(guī)喂養(yǎng)7 d以保證炎癥形成。

1.3.2 慢性束縛應(yīng)激 DNBS處理完成后，于第16天進(jìn)行慢性束縛應(yīng)激方法。將大鼠仰面置于鼠板上，用扎帶固定頸下、腋下和盆骨上3個(gè)部位，并固定上肢，以“大”字形束縛，持續(xù)3 h。束縛結(jié)束后放回籠中常規(guī)飼養(yǎng),持續(xù)7 d。

1.4 干預(yù)方法

干預(yù)操作在第24天進(jìn)行?？瞻捉M：黑布包裹固定,20 min/d，不予其他處理。模型組：同空白組。電針組：黑布包裹固定后進(jìn)行針刺。選擇雙側(cè)“天樞” “上巨虛”。穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》(中國(guó)中醫(yī)藥出版社出版)。穴位定位：“天樞”位于大鼠腹部，臍中旁開5 mm，直刺4 mm；“上巨虛”位于腓骨小頭下10 mm處，直刺7 mm。同側(cè)天樞和上巨虛連接電針儀，疏密波，頻率2/100 Hz， 強(qiáng)度以局部肌肉顫動(dòng)為準(zhǔn)，留針20 min。 西藥組：匹維溴銨片(18 mg/kg，溶于1 mL 0.9%NaCl溶液中)灌胃處理。 以上處理方法1次/d，持續(xù)7 d。

1.5 取材及指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 大鼠一般情況觀察 實(shí)驗(yàn)過程中，于造模前、造模后和干預(yù)后記錄大鼠的狀態(tài)及日常行為，每周測(cè)量1次大鼠體質(zhì)量和24 h進(jìn)食量。

1.5.2 內(nèi)臟敏感性測(cè)試 分別于造模前、造模后與干預(yù)后進(jìn)行內(nèi)臟敏感性測(cè)試，選擇腹壁撤退反射[12](Abdominal Withdrawal Reflex，AWR)檢測(cè)進(jìn)行評(píng)估。固定大鼠，球囊頭端涂抹石蠟油后緩慢插入肛門約 8 cm，用膠布帶與鼠尾固定，向自制直結(jié)腸擴(kuò)張球囊中持續(xù)90 s注水使球囊擴(kuò)張。標(biāo)記起始收縮波的潛伏期和收縮波個(gè)數(shù)。每只30 min以上重復(fù)檢測(cè)3次，取其平均值。

1.5.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(Open Field Test，OFT) 分別于造模前、造模后與干預(yù)后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)[13]，測(cè)定大鼠在5 min內(nèi)的中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間、中央?yún)^(qū)活動(dòng)距離與總距離。

1.5.4 組織取材 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后立即取材。隨機(jī)每組取6只大鼠，10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，取結(jié)腸及海馬組織，4%多聚甲醛固定12～24 h后常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片(厚度為4 μm)；另一部分保存于-80 ℃冰箱待蛋白檢測(cè)。

1.5.5 Western Blot檢測(cè)大鼠結(jié)腸SIRT1及海馬SIRT1、CREB和BDNF蛋白的表達(dá)情況 將結(jié)腸及海馬組織用冷TBS洗滌,去血,剪碎置于勻漿器，RIPA裂解液(加入蛋白酶抑制劑)冰上徹底勻漿，將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,振蕩，冰浴30 min,裂解，12 000 r/min離心5 min,提取蛋白。制備SDS-PAGE凝膠，上樣、電泳和轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2～3 h，孵育一抗(SIRT1蛋白1∶300，CREB蛋白1∶300，BDNF蛋白1∶300，GAPDH 1∶2 000)洗膜，孵育二抗，ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

1.5.6 免疫組化法檢測(cè)大鼠結(jié)腸SIRT1及海馬SIRT1、CREB和BDNF蛋白的表達(dá)情況 石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化后行抗原修復(fù)(具體操作嚴(yán)格按照試劑盒進(jìn)行)，光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)算陽性表達(dá)平均吸光度值(AOD=IOD/A)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

2.1.1 空白組 大鼠毛色光滑，整體狀態(tài)良好，動(dòng)作迅速，反應(yīng)敏捷，肛周潔凈，糞便成型呈顆粒狀。

2.1.2 模型組 造模前一般情況與空白組相同，造模后，大鼠毛色逐漸發(fā)黃，且1周后出現(xiàn)干枯現(xiàn)象，精神狀態(tài)一般，糞便尚可成型，無穢臭味，黃色較軟便，大鼠間偶有攻擊及撕咬；DNBS 造模完成后，大鼠狀態(tài)疲憊，毛發(fā)枯燥黃干，糞便稀溏，不成型，沾染肛周；慢性束縛應(yīng)激方法造模后，大鼠精神萎靡不振，毛色焦黃易脫，反應(yīng)不靈活，糞便稀溏，臭味濃，附著肛周，鼠間有撕咬現(xiàn)象，偶有舔舐腹部，畏懼實(shí)驗(yàn)人員，甚有抓咬現(xiàn)象。

2.1.3 電針組 造模前與空白組相似;造模期間，與模型組相似；造模及干預(yù)7 d后，大鼠反應(yīng)速度尚可，毛發(fā)光澤度變亮，干枯改善，畏懼及撕咬現(xiàn)象減輕，肛周附著少量黃色物，糞便基本成型，無臭穢氣味。

2.1.4 西藥組 造模前與空白組相似;造模期間，與模型組相似；造模及干預(yù)7 d后，大鼠反應(yīng)速度尚可，毛發(fā)光澤度變亮，干枯改善，畏懼及撕咬現(xiàn)象減輕，肛周附著少量黃色物，糞便基本成型，個(gè)別大鼠排出稀便，無臭穢氣味。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量及 24 h進(jìn)食量比較

與空白組比較，模型組體質(zhì)量、24 h進(jìn)食量降低(P<0.01或P<0.05)，而電針組、西藥組可有效增加體質(zhì)量及進(jìn)食量(P<0.01或P<0.05)。電針組與西藥組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1～2。

表1 各組大鼠體質(zhì)量結(jié)果

表2 各組大鼠24 h進(jìn)食量比較

2.3 各組大鼠AWR實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

干預(yù)后，模型組的第1次收縮波潛伏期明顯低于空白組(P<0.01)，電針組和西藥組明顯高于模型組(P<0.01)；90 s內(nèi)收縮波個(gè)數(shù)比較，模型組明顯高于空白組(P<0.01)，電針組與西藥組低于模型組(P<0.05)。見表3～4。

表3 各組大鼠第1次收縮波潛伏期比較

表4 各組大鼠90 s內(nèi)收縮波個(gè)數(shù)比較

2.4 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

干預(yù)后，模型組中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間、中央?yún)^(qū)活動(dòng)距離和總距離皆明顯低于空白組(P<0.01)，電針組及西藥組高于模型組(P<0.05或P<0.01)。見表5。

表5 干預(yù)后各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 結(jié)腸組織SIRT1蛋白表達(dá)量

Western blot法檢測(cè)顯示，干預(yù)后，模型組結(jié)腸組織中SIRT1蛋白表達(dá)量明顯低于空白組(P<0.01)，電針組及西藥組結(jié)腸組織中SIRT1蛋白表達(dá)量與模型組比升高(P<0.01)。見圖1、表6。

表6 各組大鼠結(jié)腸SIRT1蛋白表達(dá)量

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)示,陽性表達(dá)呈棕褐色，與空白組比較，模型組 SIRT1陽性表達(dá)減弱；與模型組比較，電針組及西藥組陽性表達(dá)增強(qiáng)。SIRT1平均吸光度值，與空白組比較，模型組明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，電針組及西藥組明顯增加(P<0.01)。見圖2、表7。

表7 各組大鼠結(jié)腸SIRT1平均吸光度比較

2.6 海馬組織SIRT1、CREB和BDNF蛋白表達(dá)量

Western blot法檢測(cè)顯示，與空白組比較，模型組海馬組織SIRT1、CREB及BDNF蛋白的表達(dá)減少(P<0.01);與模型組比較，電針組及西藥組升高(P<0.05或P<0.01)。見圖3、表8。

表8 各組大鼠海馬SIRT1、BDNF及CREB蛋白相對(duì)表達(dá)量

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)示,陽性表達(dá)呈棕褐色,與空白組比較，模型組SIRT1、CREB及BDNF陽性表達(dá)減弱；與模型組比較，電針組及西藥組SIRT1、CREB及BDNF陽性表達(dá)增強(qiáng)。平均吸光度值，與空白組比較，模型組明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，電針組及西藥組明顯增加(P<0.01或P<0.05)。見圖4、表9。

表9 各組大鼠海馬組SIRT1、BDNF及CREB平均吸光度比較

3 討論

目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為腸易激綜合征的病因尚未明了，病因?qū)W的研究主要涉及飲食因素、精神心理因素、遺傳因素、感染因素及免疫因素等，腸易激綜合征是一種多因素異質(zhì)性疾病，其機(jī)制與胃腸動(dòng)力學(xué)異常、內(nèi)臟高敏感性與腦-腸軸異常等有關(guān)[14]。一項(xiàng)為期 12 年的研究顯示，基線時(shí)無精神心理異常的IBS 患者在隨訪期發(fā)展為抑郁的風(fēng)險(xiǎn)是無任何功能性胃腸病健康對(duì)照組的1.10倍[15]。其主要機(jī)制可以用“腦-腸軸”學(xué)說來解釋，“腦-腸軸”學(xué)說是指腸道與大腦之間的雙向溝通，負(fù)性情緒通過“腦-腸軸”在腸道功能中起著重要作用[16-17]。當(dāng)嚙齒類動(dòng)物受到慢性壓力等負(fù)向情緒時(shí)，海馬體是大腦中最敏感的區(qū)域之一，慢性應(yīng)激暴露的嚙齒動(dòng)物的海馬結(jié)構(gòu)可塑性損傷[18-19]，神經(jīng)元負(fù)責(zé)整合和傳遞信號(hào)，響應(yīng)內(nèi)在和外在的信息[20]，影響突觸連接的神經(jīng)可塑性，以平衡腦功能。研究表明，神經(jīng)可塑性功能障礙是抑郁癥的基本發(fā)病機(jī)制[21]。因此，海馬結(jié)構(gòu)可塑性功能障礙可能參與IBS 伴抑郁情緒發(fā)病。

Caruso R等[22]研究發(fā)現(xiàn)在IBD患者的結(jié)腸活檢中，SIRT1表達(dá)量下調(diào)。SIRT1在老年小鼠腸上皮特異性敲除后會(huì)引起自發(fā)炎癥和結(jié)腸組織損傷，增加其對(duì)結(jié)腸炎的易感性[23]。白藜蘆醇誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生的SIRT1通過NF-κB下調(diào)炎癥，對(duì)急性腸道炎癥有保護(hù)作用[24-25]。大建中湯對(duì)IBS能通過在基因及蛋白水平上促進(jìn)SIRT1表達(dá)，激活SIRT1/NF-κB p65信號(hào)通路以達(dá)到治療IBS內(nèi)臟痛的目的[26]。SIRT1信號(hào)通路是治療IBS一條潛在的通絡(luò)。

本研究使用聯(lián)合造模法[27-28]，腹壁撤退反射以示大鼠腸道對(duì)壓力刺激的痛覺敏感度，是 IBS模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)[29]。在本實(shí)驗(yàn)中，AWR潛伏期明顯縮短、收縮波個(gè)數(shù)明顯增多，說明IBS造模成功。IBS 中醫(yī)中屬“腹痛”“泄瀉”等疾病范疇，中醫(yī)認(rèn)為其病位在腸。天樞穴，大腸經(jīng)募穴，具有疏調(diào)腸腑、導(dǎo)滯通便的功效[30]。上巨虛，大腸經(jīng)的下合穴，善理氣化滯、通調(diào)腸腑。經(jīng)研究“合募配穴”治療腸易激綜合征療效顯著[31]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用電針大腸經(jīng)“合募配穴”，即“天樞”“上巨虛”，電針治療后，AWR收縮波潛伏期增長(zhǎng)，收縮個(gè)數(shù)降低，說明IBS大鼠內(nèi)臟敏感性降低。而IBS大鼠結(jié)腸SIRT1表達(dá)量降低，電針治療后SIRT1表達(dá)量增高，說明電針可調(diào)控結(jié)腸SIRT1表達(dá)量，激活了結(jié)腸SIRT1信號(hào)。

SIRT1也是大腦中一種重要的調(diào)節(jié)因子，特別是在海馬體、基底神經(jīng)節(jié)和前額葉皮質(zhì)中[32]。既往研究[33]表明，SIRT1調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化、保護(hù)和突觸可塑性，這些功能與認(rèn)知功能主要相關(guān)。海馬中 SIRT1具有抗抑郁的作用，慢性不可預(yù)測(cè)溫和應(yīng)激(Chronic unpredictable mild stress，CUMS)建模的抑郁大鼠海馬齒狀回的SIRT1活性降低[34]。既往研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1缺失會(huì)導(dǎo)致突觸可塑性損傷，BDNF和CREB表達(dá)降低[35]。而腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF是神經(jīng)元活動(dòng)和突觸可塑性之間的調(diào)節(jié)器[33]，BDNF的改變是神經(jīng)可塑性受損的基礎(chǔ)[36]，CREB又是調(diào)節(jié)BDNF和記憶形成的重要轉(zhuǎn)錄因子[37]，CUMS暴露降低CREB/BDNF的表達(dá)，而電針及西藥上調(diào)CREB磷酸化，促進(jìn)CREB下游靶基因BDNF的轉(zhuǎn)錄[38]，調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性損傷。

本實(shí)驗(yàn)電針治療后，中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間、中央?yún)^(qū)活動(dòng)距離與總距離皆明顯增加，說明經(jīng)過電針干預(yù)后，IBS 大鼠抑郁情緒得到一定的緩解。檢測(cè)海馬組織SIRT1、BDNF及CREB結(jié)果表明其表達(dá)量均降低，即IBS伴抑郁情緒大鼠海馬組織SIRT1、 BDNF及CREB表達(dá)下調(diào)。以往研究[10]表明 SIRT1可介導(dǎo)CREB和BDNF表達(dá)，SIRT1缺失導(dǎo)致miR-134表達(dá)上調(diào)，抑制CREB mRNA翻譯，下調(diào)CREB和BDNF，導(dǎo)致突觸可塑性和記憶受損。近期研究[39-41]發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥治療抑郁小鼠，可能是通過 cAMP/CREB/BDNF信號(hào)通路，上調(diào)海馬CREB、p CREB及BDNF水平，修復(fù)突觸可塑性，保護(hù)神經(jīng)可塑性，進(jìn)而改善抑郁小鼠的認(rèn)知行為。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明電針上調(diào)了大鼠海馬SIRT1、BDNF及CREB蛋白的表達(dá)，抑郁情緒得以改善，這與以往的研究相符。由此，筆者認(rèn)為電針可調(diào)控結(jié)腸SIRT1表達(dá)量，可能通過腸道與大腦之間的雙向溝通，激活了海馬組織 SIRT1/CREB/BDNF信號(hào)通路，這可能是電針對(duì)腸易激綜合征伴抑郁情緒的潛在作用機(jī)制。