劉朝霞,李玎玎,許曉男,王 喆△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)是一種以血性腹瀉和里急后重為主要癥狀的慢性炎癥性腸病，其病程遷延，病情反復(fù)，可造成腸黏膜持續(xù)炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。穴位埋線是以針灸理論為指導(dǎo)的一種傳統(tǒng)中醫(yī)外治法，以羊腸線埋入腧穴，通過(guò)腸線在穴位長(zhǎng)效的刺激作用，達(dá)到“深納而久留之，以治頑疾”的目的，對(duì)UC癥狀具有明顯的改善作用，且副作用較小，已廣泛應(yīng)用于UC的臨床治療[2]。然而，關(guān)于其對(duì)UC的研究報(bào)道仍較少。UC的病因和發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前研究認(rèn)為是由遺傳、感染、免疫異常、環(huán)境以及飲食等多種因素共同作用下引發(fā)腸黏膜免疫炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致黏膜結(jié)構(gòu)和功能受損[3]。白細(xì)胞介素-27(Interleukin-27,IL-27)是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型炎性細(xì)胞因子，在炎癥進(jìn)程中具有抗炎和促炎的雙向調(diào)控作用，參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生[4]。含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLR family,pyrin domain containing 3,NLRP3)是存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一類多蛋白復(fù)合物，活化的NLRP3炎癥小體具有強(qiáng)大的促炎活性，能夠引起多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)，是導(dǎo)致UC病情加重的重要機(jī)制之一[5]。有研究發(fā)現(xiàn)[6]，IL-27可通過(guò)抑制NLRP3的激活和表達(dá)來(lái)減輕UC炎癥程度。本研究通過(guò)觀察穴位埋線對(duì)UC大鼠IL-27及NLRP3炎癥體表達(dá)的影響，探討穴位埋線治療UC的作用機(jī)制，為其臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠42只，雄性，體質(zhì)量200～220 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK黑2021-010，于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度保持20～22 ℃，相對(duì)濕度50%，光照與黑暗交替各12 h。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 柳氮磺胺吡啶(SASP)腸溶片(0.25 g/片),上海福達(dá)制藥有限公司，批號(hào)：990608)；葡聚糖硫酸鈉(MP Biomedicals公司，批號(hào)：M8669);7號(hào)無(wú)菌埋線針(鎮(zhèn)江高冠醫(yī)療器械有限公司);可吸收外科縫線(山東博達(dá)醫(yī)療有限公司);白細(xì)胞介素-18(IL-18)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、γ-干擾素(IFN-γ)和白細(xì)胞介素-27(IL-27)大鼠ELISA試劑盒(深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為：20210612、20210529、20210510和20210526)；抗含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)和IL-27抗體(Santa Cruz公司，批號(hào)分別為：058206、059150和052243)；RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，批號(hào)分別為：DR060A、D543A，基因引物由上海捷瑞生物工程有限公司提供，貨號(hào)：S0419)。

1.2.2 儀器 組織切片機(jī)(Leica公司，型號(hào)：RM 2235);光學(xué)顯微鏡(Leica公司，型號(hào)：DM750);多功能酶標(biāo)儀(Tecan 公司，型號(hào)：GENIOSPLOS);電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad公司，型號(hào)：EC3 型);RCR儀(ABI公司，型號(hào)：9902)。

1.3 模型建立與治療

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取10只作為空白組，其余大鼠自由飲用3%葡聚糖硫酸鈉(DSS)水溶液7 d，以建立UC模型。造模結(jié)束后抽取2只大鼠取結(jié)腸組織，行HE染色觀察病理形態(tài)改變，以出現(xiàn)腹瀉、血便等癥狀及光鏡下結(jié)腸黏膜彌漫性破壞、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和潰瘍形成為模型建立成功[7]。造模成功后，將其余大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、藥物組和穴位埋線組，每組各10只。藥物組給予SASP溶液0.5 g/kg連續(xù)灌胃治療14 d；穴位埋線組選取雙側(cè)“足三里”“上巨虛”“天樞”“大腸俞”給予穴位簡(jiǎn)易埋線治療，穴位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》進(jìn)行定位，將羊腸線(0.5 cm)置于0.9%生理鹽水清洗后，以7號(hào)無(wú)菌埋線針推入上述腧穴內(nèi)，其中“足三里” “上巨虛”直刺，“天樞”“大腸俞”從腧穴下方向上平刺，將針芯推出時(shí)同時(shí)退出針管，將羊腸線埋入后，用醫(yī)用藥棉按壓針孔1 min，每7 d干預(yù)1次，共治療3次?？瞻捉M及模型組正常飼養(yǎng)，不予處理。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 一般狀況及DAI、CMDI評(píng)分 觀察記錄各組大鼠精神狀況、體質(zhì)量、進(jìn)食飲水、大小便及糞便性狀等情況變化，治療結(jié)束后參照文獻(xiàn)[8-9]進(jìn)行疾病活動(dòng)度指數(shù)(DAI)和結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI)評(píng)分。DAI評(píng)分：體質(zhì)量不變?yōu)?分，減輕1%～5%為1分，減輕6%～10%為2分，減輕11%～15%為3分，減輕>15%為4分；糞便性狀正常為0分，松散呈半稀狀為2分，稀疏黏稠為4分；糞便無(wú)潛血為0分，潛血陽(yáng)性為2分，顯性血便為4分。DAI=(體質(zhì)量評(píng)分+糞便性狀評(píng)分+潛血評(píng)分)/3。CMDI評(píng)分：未見(jiàn)腸黏膜損傷為0分；腸黏膜輕度充血水腫，未出現(xiàn)潰瘍、糜爛為1分；腸黏膜輕、中度充血水腫，出現(xiàn)糜爛、粘連為2分；腸黏膜高度充血水腫，出現(xiàn)壞死、潰瘍(直徑<1 cm)為3分；腸黏膜潰瘍較大(直徑>1 cm)或全腸壁壞死為4分。

1.4.2 結(jié)腸長(zhǎng)度及組織病理學(xué)變化觀察 治療結(jié)束后，測(cè)量各組大鼠結(jié)腸組織全結(jié)腸長(zhǎng)度，隨后將結(jié)腸縱行剪開(kāi)，0.9%生理鹽水清洗后，取部分組織置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，依次放入低濃度到高濃度乙醇溶液中浸泡脫水，再置于二甲苯中透明，液體石蠟包埋，冷卻后切片機(jī)作5 μm切片，HE 染色，再經(jīng)脫水、透明后封片，光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化并拍照。

1.4.3 血清IL-18、IL-1β、IFN-γ及IL-27水平檢測(cè) 治療結(jié)束后，各組大鼠腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min下離心15 min分離血清，置于-20 ℃冰箱中保存待測(cè)。按照ELISA試劑盒操作步驟進(jìn)行檢測(cè)：血清臨用前于室溫下平衡1 h，3 000 r/min下離心15 min，樣品孔分別加入待測(cè)樣品10 μL，樣品稀釋劑40 μL和酶標(biāo)抗體100 μL，同時(shí)設(shè)置空白孔和標(biāo)準(zhǔn)孔，于37 ℃溫箱中反應(yīng)1 h，加入洗滌劑清洗6次，加底物液顯色，于37 ℃溫箱避光反應(yīng)15 min后，加入終止液以終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450 nm下檢測(cè)各孔OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔OD值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入各樣品孔OD值得出血清樣本中IL-18、IL-1β、IFN-γ及IL-27的水平。

1.4.4 結(jié)腸組織NLRP3、caspase-1及IL-27蛋白表達(dá)檢測(cè) 取各組大鼠結(jié)腸組織100～200 mg，置于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩４±砗脱逯笜?biāo)檢測(cè)結(jié)束后，每組分別選取5只大鼠，結(jié)腸組織于常溫下解凍，無(wú)菌剪剪碎，勻漿機(jī)勻漿，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法于562 nm下測(cè)定總蛋白濃度。配置 SDS-PAGE凝膠，加入電泳緩沖液，將10 μL蛋白樣品加入上樣孔，經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)入PVDF 膜，加入5%TBST脫脂奶粉，于室溫下封閉2 h，滴加一抗于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，滴加二抗于室溫孵育2 h，加入顯影液顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)曝光并拍照。重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，采用Image J 軟件定量分析各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.5 結(jié)腸組織NLRP3、 caspase-1及IL-27 mRNA表達(dá)檢測(cè) 取各組大鼠結(jié)腸組織50 mg，置于-80 ℃冰箱中凍存待測(cè)，每組分別選取5只大鼠，結(jié)腸組織室溫下自然解凍，無(wú)菌剪剪碎成若干碎塊，Trizol一步法提取組織總RNA，采用紫外分光光度儀測(cè)定RNA 濃度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，隨后進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94 ℃，5 min; 95 ℃，30 s;60 ℃，30 s;72 ℃，30 s，共擴(kuò)增 40個(gè)循環(huán)，循環(huán)完畢后72 ℃ 延伸5 min。重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法分析結(jié)腸組織NLRP3、caspase-1及IL-27的相對(duì)mRNA表達(dá)量?；蛞镄蛄幸?jiàn)表1。

表1 基因引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況和DAI、CMDI評(píng)分

各組造模過(guò)程中均未出現(xiàn)大鼠死亡?？瞻捉M精神狀況良好，進(jìn)食、飲水量及大小便正常。模型組造模后精神不佳，少食懶動(dòng),體重減輕明顯，大便頻次增加、呈稀便或黏液狀血便。模型組DAI、CMDI評(píng)分與空白組比較顯著升高(P<0.01)。藥物組和穴位埋線組大鼠治療后精神狀況逐漸轉(zhuǎn)好，食量增多，體質(zhì)量減輕趨勢(shì)緩和，稀便、黏血便癥狀明顯改善，DAI、CMDI評(píng)分較模型組顯著下降(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠 DAI、CMDI評(píng)分比較

2.2 大鼠結(jié)腸長(zhǎng)度

模型組大鼠與空白組比較，結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短(P<0.01)。藥物組和穴位埋線組大鼠經(jīng)治療后，結(jié)腸長(zhǎng)度較模型組明顯增長(zhǎng)(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠結(jié)腸長(zhǎng)度比較

2.3 大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化

HE染色可見(jiàn)，空白組大鼠結(jié)腸黏膜完整，腺體排列規(guī)則，腸腺上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)潰瘍和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組黏膜結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，可見(jiàn)黏膜上皮變薄，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)豐富，結(jié)腸黏膜潰瘍明顯、黏膜下層及肌層可見(jiàn)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。藥物組和穴位埋線組大鼠經(jīng)治療后，腸黏膜損傷較模型組明顯改善，黏膜結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，腺體排列良好，潰瘍減輕，可見(jiàn)輕微充血和水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見(jiàn)圖1。

2.4 大鼠血清中炎性因子表達(dá)水平

模型組大鼠與空白組比較，血清中IL-18、IL-1β及IFN-γ的水平顯著升高，IL-27的水平明顯降低(P<0.01)。藥物組和穴位埋線組大鼠血清IL-18、IL-1β、IFN-γ的水平較模型組明顯降低，IL-27的水平較模型組明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血清中IL-18、IL-1β、IFN-γ及IL-27水平比較

2.5 大鼠結(jié)腸組織中NLRP3、caspase-1及IL-27的蛋白表達(dá)

與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中NLRP3、caspase-1的蛋白表達(dá)明顯增多，IL-27表達(dá)顯著減少(P<0.01)。藥物組和穴位埋線組NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)較模型組顯著減少，IL-27表達(dá)與模型組比較明顯增多(P<0.01)。見(jiàn)圖2、表5。

表5 各組大鼠結(jié)腸組織中NLRP3、caspase-1及IL-27蛋白比較

2.6 大鼠結(jié)腸組織中NLRP3、caspase-1及IL-27 mRNA表達(dá)

模型組大鼠結(jié)腸組織中NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)較空白組明顯增多，IL-27 mRNA表達(dá)顯著減少(P<0.01)。與模型組比較，藥物組和穴位埋線組NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)顯著減少，IL-27 mRNA表達(dá)明顯增多(P<0.01)。見(jiàn)表6,各基因溶解曲線見(jiàn)圖3。

表6 各組大鼠結(jié)腸組織中NLRP3、caspase-1及IL-27 mRNA比較

3 討論

UC以結(jié)腸黏膜糜爛、潰瘍、彌漫性炎癥等病變及腹瀉、黏液血便與體質(zhì)量減輕等臨床癥狀為主要特征，病程遷延，發(fā)作與緩解常反復(fù)交替，且具有一定的癌變風(fēng)險(xiǎn)，被世衛(wèi)組織列為現(xiàn)代疑難疾病之一[10]。目前臨床常依靠促腎上腺皮質(zhì)激素、抗感染及免疫抑制劑控制UC癥狀，然而藥物所引起的副作用較多，停藥后復(fù)發(fā)率高，且部分難治性患者應(yīng)用藥物治療后未見(jiàn)改善跡象[11]。中醫(yī)立足整體，善于辨證施治，在UC的診治過(guò)程中展現(xiàn)了較大優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，針刺、艾灸和穴位埋線等中醫(yī)外治法作為輔助療法已在UC的臨床治療中得到廣泛應(yīng)用[12]。

穴位埋線是將羊腸線埋入腧穴，由局部的機(jī)械性刺激激活腧穴特定功效，并產(chǎn)生一種持久而柔和的針感效應(yīng)。與常規(guī)針刺相比，穴位埋線對(duì)腧穴的刺激更強(qiáng)且針感更為持久。羊腸線被機(jī)體吸收后，作為異體蛋白亦激發(fā)了機(jī)體的應(yīng)激能力和免疫功能[13]。多項(xiàng)臨床研究顯示[14-15]，穴位埋線可有效修復(fù)腸黏膜損傷，減輕炎癥反應(yīng)，對(duì)UC患者具有良好療效?，F(xiàn)代研究亦證實(shí)[16]，穴位埋線能夠改善腸道蠕動(dòng)和腸血流，具有促進(jìn)潰瘍修復(fù)的作用。溫淑婷等[17]通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘系統(tǒng)分析了近15年來(lái)穴位埋線治療UC的選穴規(guī)律，發(fā)現(xiàn)“足三里”“天樞”“大腸俞”使用頻次最高。天樞是大腸經(jīng)的募穴，能夠調(diào)暢腸腑、化瘀活血，為治療腸道疾患的首選腧穴。大腸俞為大腸經(jīng)背俞穴，與天樞俞、募配伍，通行大腸腑氣以達(dá)到止瀉目的。上巨虛為大腸經(jīng)下合穴，與天樞穴合募相配，可起到調(diào)腸和胃作用。足三里有溫胃健脾、和中止瀉之效，又可促進(jìn)一身氣血運(yùn)行以調(diào)理腸胃運(yùn)化，與上巨虛合用具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、促進(jìn)潰瘍修復(fù)的作用[18-19]。

本研究采用3% DSS水溶液建立UC大鼠模型，選取天樞、大腸俞、上巨虛及足三里穴進(jìn)行穴位埋線治療，觀察大鼠DAI、CMDI評(píng)分，結(jié)腸長(zhǎng)度及結(jié)腸組織病理形態(tài)改變以評(píng)價(jià)穴位埋線對(duì)UC腸黏膜的修復(fù)作用。研究結(jié)果提示，經(jīng)穴位埋線治療后，UC大鼠DAI和CMDI評(píng)分顯著降低，結(jié)腸長(zhǎng)度明顯增長(zhǎng)，有效改善了大鼠結(jié)腸黏膜水腫、充血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，潰瘍明顯愈合。表明穴位埋線對(duì)UC腸黏膜損傷具有顯著的抗炎修復(fù)作用。

UC患者普遍可見(jiàn)腸黏膜持續(xù)性炎癥反應(yīng)，多數(shù)研究認(rèn)為，炎癥介質(zhì)的過(guò)度釋放在UC發(fā)病和轉(zhuǎn)歸過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[20]。NLRP3是目前研究最為深入的炎癥體，由招募接頭蛋白ASC、效應(yīng)分子caspase-1和NLRP3所構(gòu)成，活化的NLRP3可促進(jìn)炎癥介質(zhì)IL-18和IL-1β的表達(dá)，在UC發(fā)展中起到促炎作用[5]。而IL-27是近年發(fā)現(xiàn)的IL-12家族細(xì)胞因子，在炎癥進(jìn)程中具有抗炎和促炎的雙重調(diào)節(jié)作用。炎癥初期IL-27能夠產(chǎn)生 IFN-γ、IL-18等炎性因子來(lái)促進(jìn)炎癥反應(yīng)，炎癥進(jìn)展過(guò)程中，IL-27又可通過(guò)上調(diào)抑炎因子的表達(dá)來(lái)達(dá)到抗炎效應(yīng)[21-22]。在自身免疫性腦脊髓炎中，IL-27能夠促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)分子CD39的表達(dá)，降低細(xì)胞外ATP濃度，進(jìn)而下調(diào)NLRP3炎癥小體的核苷酸依賴性激活[23]。有研究證實(shí)[6]，DSS誘導(dǎo)的小鼠UC模型中，IL-27可通過(guò)抑制NLRP3和caspase-1的活化，進(jìn)而下調(diào)IL-18和IL-1β的表達(dá)，發(fā)揮對(duì)UC炎癥的緩解作用。本研究中，UC大鼠血清IL-18、IL-1β和IFN-γ炎癥因子的水平均明顯升高，IL-27的水平顯著降低，穴位埋線治療后IL-27的水平明顯提高，同時(shí)抑制了IL-18、IL-1β、IFN-γ水平的升高。Western-blot和RT-RCR結(jié)果顯示，UC大鼠結(jié)腸組織中NLRP3和caspase-1蛋白和mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)，而IL-27的表達(dá)水平與NLRP3、caspase-1呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。經(jīng)穴位埋線治療后，IL-27表達(dá)明顯升高，同時(shí)顯著降低了NLRP3、caspase-1的表達(dá)水平。提示穴位埋線對(duì)IL-27表達(dá)的上調(diào)及對(duì)NLRP3激活的抑制可能是其發(fā)揮對(duì)UC抗炎保護(hù)作用的重要機(jī)制。

綜上所述，本研究表明穴位埋線對(duì)DSS所誘導(dǎo)的UC模型大鼠具有明顯的治療作用，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)IL-27的表達(dá)來(lái)抑制NLRP3激活，從而減少炎性細(xì)胞因子的生成，減輕炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮對(duì)UC腸黏膜損傷的修復(fù)作用。