易 婷， 楊四梅， 黎升倩， 曹秋娥， 李 菲*

(云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，云南昆明 650091)

長(zhǎng)春花(Catharanthusroseus(L.)G.Don)為夾竹桃科(Apocynaceae)長(zhǎng)春花屬植物，在我國(guó)廣東、廣西、云南及海南等地廣泛栽培。生物堿類是長(zhǎng)春花的主要活性成分，對(duì)多種癌癥有效，包括惡性淋巴瘤、橫紋肌肉瘤、絨毛上皮癌和白血病等[1]。長(zhǎng)春堿(Vinblastine，VLB)和長(zhǎng)春新堿(Vincristine，VCR)是目前臨床上常用的抗腫瘤藥，VLB在霍奇金淋巴瘤治療中占重要地位[2]，VCR用于白血病和淋巴癌等的治療[3]。文多靈(Vindoline，VDL)和長(zhǎng)春質(zhì)堿(Catharanthine，CTR)是VLB和VCR的合成前體[4]，是著名的生物堿類降血脂藥物[5]。因此，對(duì)長(zhǎng)春花中這4種活性成分分離分析方法的研究具有重要意義。

目前，文獻(xiàn)已報(bào)道的對(duì)長(zhǎng)春花生物堿類成分的分離分析方法主要有：液相色譜-質(zhì)譜法[6,7]、高效液相色譜法[8 - 11]、薄層掃描法和非水毛細(xì)管電泳法[12]，其中高效液相色譜法最為常見(jiàn)。毛細(xì)管電泳與高效液相色譜法相比，具有分析時(shí)間短、適用范圍廣且樣品消耗量少等優(yōu)勢(shì)。目前用高效毛細(xì)管電泳同時(shí)分離分析長(zhǎng)春花中的長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春質(zhì)堿和文多靈的相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法，建立了一種14 min內(nèi)同時(shí)分離檢測(cè)長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春質(zhì)堿和文多靈的新方法，可用于長(zhǎng)春花藥材中4個(gè)目標(biāo)組分的同時(shí)檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

P/ACETMMDQ型毛細(xì)管電泳儀(美國(guó)，Sciex)；未涂層石英毛細(xì)管(70 cm×75 μm i.d.，有效長(zhǎng)度50 cm)(河北省永年銳灃色譜器件有限公司)；ST2100型pH計(jì)(奧豪斯儀器有限公司)。

長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春質(zhì)堿、文多靈標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品鑒定所)，用甲醇作溶劑，配制濃度為1.0 mg/mL的長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春質(zhì)堿和文多靈的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃冰箱保存；紫紅色的長(zhǎng)春花莖葉和花瓣，紅色和白色的長(zhǎng)春花莖葉藥材，經(jīng)云南大學(xué)生科院陸樹(shù)剛鑒定為夾竹桃科長(zhǎng)春花屬(Catharanthus)植物的干燥莖葉和花瓣。實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純，水為超純水。

1.2 樣品溶液的制備

分別準(zhǔn)確稱取1.0000 g完全干燥后的紫紅色長(zhǎng)春花莖葉和花瓣、紅色和白色的長(zhǎng)春花莖葉，置于250 mL錐形瓶中，加入15 mL飽和Ca(OH)2溶液和35 mL甲醇，超聲提取60 min，過(guò)濾后減壓蒸餾除去溶劑，用甲醇溶解定容至10 mL，于4 ℃冰箱保存。所有溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾使用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

以H3PO4-NaH2PO4(NaH2PO4濃度為39 mmol/L，pH=4.31)為運(yùn)行緩沖溶液，加入2.0%的正丁醇和10%的乙腈添加劑。儀器條件：分離電壓20 kV，進(jìn)樣5 s(壓力3447.38 Pa)，柱溫25 ℃和波長(zhǎng)214 nm。

儀器開(kāi)機(jī)和兩次運(yùn)行間，依次用0.1 mol/L NaOH、純水和運(yùn)行緩沖溶液沖洗3、3、5 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 運(yùn)行緩沖溶液的pH值對(duì)分離的影響

長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春質(zhì)堿和文多靈結(jié)構(gòu)中的氮原子，在酸性條件下可發(fā)生質(zhì)子化。因此，實(shí)驗(yàn)采用磷酸鹽為背景電解質(zhì)，在酸性介質(zhì)(pH=3.40～4.49)中研究了pH值對(duì)分離的影響。見(jiàn)圖1，pH增大，遷移時(shí)間減短，但分離度下降。為了保證分離度，同時(shí)縮短分離時(shí)間，實(shí)驗(yàn)選擇以pH=4.31的H3PO4-NaH2PO4溶液(NaH2PO4濃度為39 mmol/L)作為運(yùn)行緩沖溶液。

圖1 pH值對(duì)4種生物堿遷移時(shí)間的影響Fig.1 Effect of pH on migration time of four alkaloids

2.2 正丁醇濃度對(duì)分離的影響

為增大分離度和改善峰形，在上述運(yùn)行電解質(zhì)溶液(pH=4.31)中添加正丁醇，有機(jī)溶劑的加入，可以增加樣品溶解性使其形成均一溶液，同時(shí)降低電滲流，改善分離。實(shí)驗(yàn)研究了正丁醇(體積分?jǐn)?shù)于0.2%～2.4%之間)對(duì)分離度的改善情況(圖2)。結(jié)果表明，隨濃度增加，遷移時(shí)間延長(zhǎng)，長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿間分離度有所改善。當(dāng)正丁醇為2.0%時(shí)，4種組分間分離度和峰形較好。因此，實(shí)驗(yàn)選擇在緩沖體系中添加體積分?jǐn)?shù)為2.0%的正丁醇。

圖2 正丁醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)4種生物堿遷移時(shí)間的影響Fig.2 Effect of n-butanol volume fraction on migration time of four alkaloids

2.3 乙腈濃度對(duì)分離的影響

為改善基線噪音，增大分離度，研究了加入不同濃度乙腈對(duì)各組分分離的影響。如圖3，增大乙腈濃度，基線平穩(wěn)，乙腈為10%時(shí)，各組分間分離度最佳，且峰形尖銳，基線良好。但當(dāng)乙腈濃度大于10%時(shí)，長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿的分離度下降，甚至出現(xiàn)重疊。因此，實(shí)驗(yàn)選擇10%乙腈。

圖3 乙腈體積分?jǐn)?shù)對(duì)4種生物堿遷移時(shí)間的影響Fig.3 Effect of acetonitrile volume fraction on migration time of four alkaloids

2.4 儀器條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了分離電壓和進(jìn)樣時(shí)間對(duì)分離的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在18～25 kV范圍內(nèi)，隨分離電壓增大，峰形尖銳，分離度下降；進(jìn)樣時(shí)間在3～9 s內(nèi)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，峰形展寬，且分離度下降。綜合考慮，確定分離電壓20 kV，3.447 kPa進(jìn)樣5 s。

優(yōu)化條件下14 min內(nèi)長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春質(zhì)堿和文多靈實(shí)現(xiàn)基線分離，且峰形較好，見(jiàn)圖4。具有代表性的紫紅色長(zhǎng)春花莖葉樣品的電泳圖如圖5。

圖4 優(yōu)化電泳條件下4種標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的電泳圖Fig.4 Electropherogram of mixed solution of four standards under optimized electrophoresis conditions1.vinblastine;2.vincristine;3.catharanthine;4.vindoline.

圖5 紫紅色長(zhǎng)春花莖葉樣品的電泳圖Fig.5 Electropherogram of purplish red leaves and stems of Catharanthus roseus1.vinblastine;2.vincristine;3.catharanthine;4.vindoline.

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性關(guān)系驗(yàn)證將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液進(jìn)行電泳分析。以各組分的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，結(jié)果見(jiàn)表1。配制5份質(zhì)量濃度均為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液進(jìn)行測(cè)定，由表1可知，各組分峰面積與遷移時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于2%。

表1 待測(cè)組分的工作曲線和重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

2.5.2 中間精密度同一人員連續(xù)2 d分別進(jìn)樣5次測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的峰面積和保留時(shí)間RSD值均小于3.0%。不同分析人員，分別進(jìn)樣5次測(cè)定，所得結(jié)果的峰面積和保留時(shí)間RSD值均小于4.0%。

2.5.3 穩(wěn)定性取同一樣品溶液，分別在室溫放置0、2、4、6、8、16 h后，測(cè)定長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春質(zhì)堿和文多靈的含量，各組分含量的RSD值均小于4.3%，說(shuō)明該方法有較好的穩(wěn)定性。

2.5.4 準(zhǔn)確度通過(guò)測(cè)定長(zhǎng)春花藥材的加標(biāo)回收率驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，各組分的加標(biāo)回收率都在93.7%～108.9%之間，RSD值均不大于4.1%，由此證明該方法準(zhǔn)確度符合要求。

2.6 樣品分析

將上述毛細(xì)管區(qū)帶電泳新方法用于分離測(cè)定4種樣品溶液中的4種目標(biāo)組分，結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，4種長(zhǎng)春花藥材中各目標(biāo)組分的質(zhì)量濃度有顯著差異，其中紫色花瓣樣品中目標(biāo)成分含量少，紅色和白色的長(zhǎng)春花莖葉樣品中目標(biāo)成分含量相對(duì)較高。表中各組分含量的RSD值均小于4.0%，說(shuō)明測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，該方法可行，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

表2 樣品中4種生物堿的含量(n=3)

3 結(jié)論

采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法，建立了一種可在14 min內(nèi)同時(shí)分離檢測(cè)長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春質(zhì)堿和文多靈的新方法。該方法可實(shí)現(xiàn)4種目標(biāo)成分的基線分離與準(zhǔn)確檢測(cè)，具有較高的實(shí)用價(jià)值。