邵勁松， 宣 芳， 薛雯蔚， 林志慧， 陳昌云*

(1.南京曉莊學(xué)院環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 211171；2.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心，江蘇南京 210036)

近年，新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)全球大流行，而新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)持續(xù)變異，傳播鏈一再延長(zhǎng)，影響日益復(fù)雜，全球疫情不容樂(lè)觀。國(guó)內(nèi)外各個(gè)研究機(jī)構(gòu)一直都在開(kāi)展變異毒株的藥物研究工作。最新研究成果[1 - 4]顯示，“三藥三方”的代表藥物連花清瘟對(duì)α、β和δ毒株均有抑制效果，顯示了穩(wěn)定的體外抗病毒作用。連花清瘟顆粒是一種中藥復(fù)方制劑，藥方中含有炒苦杏仁、連翹、炙麻黃、薄荷腦、魚(yú)腥草、金銀花、廣藿香、大黃、紅景天和甘草等多種中草藥[5]，具有清瘟解毒、泄熱宣肺的效果。其中，炒苦杏仁的主要成分苦杏仁苷，金銀花中的綠原酸以及連翹中連翹苷對(duì)本品發(fā)揮療效起到重要作用[6 - 8]。該藥的藥理性質(zhì)研究表明[9,10]，連花清瘟顆粒對(duì)大多數(shù)病毒均有對(duì)抗作用，通常用于流行性感冒病毒、柯薩奇病毒、呼吸道合胞病毒(HRSV)、單純皰疹病毒等多種病毒，適用于發(fā)熱或者高熱不退，頭痛、咳黃痰、身體疼痛、鼻塞，以及流黃鼻涕、咽干、咽痛等癥狀，對(duì)于新型冠狀病毒肺炎普通型患者的發(fā)熱、咳嗽、乏力等癥狀能起到很好的治療效果。因此，在變異毒株沖擊我國(guó)的新形勢(shì)下，利用好兼具中醫(yī)特色和藥理依據(jù)的中成藥開(kāi)展群防群治，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

中藥成分極其復(fù)雜，難以保證其質(zhì)量一致性。2020版《中國(guó)藥典》規(guī)定連花清瘟顆粒中連翹苷含量可作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)之一，但就其成分的多樣性而言，僅測(cè)定其中一種成分含量很難客觀真實(shí)地反映其內(nèi)在質(zhì)量的優(yōu)劣。中藥指紋圖譜是目前中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制的有效手段。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于連花清瘟指紋圖譜的方法主要為高效液相色譜(HPLC)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)。李正杰等[11]采用超高效液相色譜(UPLC)法建立連花清瘟膠囊超聲逆流提取液的指紋圖譜，共標(biāo)定27個(gè)共有峰，指認(rèn)其中4個(gè)共有峰，11批連花清瘟膠囊超聲逆流提取液指紋圖譜的相似度均為0.991～1.000。蘇愛(ài)國(guó)等[12]采用HPLC法建立連花清瘟膠囊多成分含量測(cè)定及其指紋圖譜分析，對(duì)其中的5個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行定量測(cè)定，確定了14個(gè)共有峰，利用相似度軟件對(duì)10批樣品的指紋圖譜進(jìn)行分析，各批樣品相似度均大于0.931。郭璐瑤等[6]同時(shí)對(duì)連花清瘟顆粒中連翹苷、連翹酯苷A、綠原酸、新綠原酸等多種有效成分的含量進(jìn)行測(cè)定，并研究了其指紋圖譜，確定了14個(gè)共有峰。目前液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在連花清瘟顆粒指紋圖譜的建立方面鮮有報(bào)道?；诖耍狙芯客ㄟ^(guò)超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-Q-TOF-MS)建立連花清瘟顆粒的HPLC指紋圖譜，確認(rèn)其化學(xué)成分，并根據(jù)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)體系》對(duì)其進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)和化學(xué)模式識(shí)別方法分析，以期為其質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型液相色譜儀(美國(guó)，安捷倫科技有限公司)；LC-3A型超高效液相色譜儀；AUY120電子天平(日本，Shimadzu公司)；Triple TOF 4600飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)，SCIEX公司)；KQ-200KDB高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)。

連翹苷、大黃酸、大黃素、大黃酚、綠原酸對(duì)照品(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。無(wú)水乙醇(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(色譜純，美國(guó)TEDIA試劑公司)；磷酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；娃哈哈純凈水(市售)。

連花清瘟顆粒(批號(hào)：B2005056/B2001056/2006041/2006023/2007006/2004010/2002007/1910007/2001061/2006006，北京以嶺藥業(yè)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 高效液相色譜條件Swell Chromplus TM-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；以0.1%磷酸為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B；梯度洗脫程序：0～10 min，10%B；10～20 min，10%～22%B；20～30 min，22%～30%B；30～45min，30%～68%B；45～60 min，68%～75%B；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

1.2.2 超高效液相色譜-質(zhì)譜條件ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7μm)；以0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相A、0.1%甲酸乙腈為流動(dòng)相B；梯度洗脫程序：0～1 min，2%B；1～8 min，2%～45%B；8～10 min，45%～98%B；10～12 min，98%B；12～16 min，98%～2%B；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：40 ℃。質(zhì)譜條件：電噴霧電離正離子模式，離子源電壓為5 500 V，離子源溫度為500 ℃，去簇電壓(DP)為60 V，霧化氣體為氮?dú)?，?44.75 kPa，輔助氣為344.75 kPa，氣簾氣為172.37 kPa。一級(jí)質(zhì)譜母離子掃描范圍為50～1 000 Da，碰撞能量(CE)為10 eV；二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍為40～1 000 Da，碰撞能量(CE)為35 eV。

1.3 試液配制

1.3.1 對(duì)照品溶液精密稱取綠原酸、大黃酸各2 mg，連翹苷、大黃素、大黃酚各1 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇使其溶解，稀釋并定容至刻度，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，即得。

1.3.2 供試品溶液取供試品適量，研細(xì)至粉末狀，精密稱取2 g，置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇適量，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出放冷，稱定質(zhì)量，用50%甲醇-水溶液補(bǔ)足減失重量并定容至刻度，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

分別考察50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇、50%乙醇和水作為提取溶劑對(duì)色譜系統(tǒng)出峰情況的影響。結(jié)果表明，采用50%甲醇作提取溶劑時(shí)，提取率良好，測(cè)得色譜峰數(shù)最穩(wěn)定、峰形最佳。故選擇50%甲醇作為提取溶劑。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相結(jié)合2020年版《中國(guó)藥典》中連花清瘟顆粒的含量測(cè)定方法[5]，分別考察0.1%磷酸-乙腈、0.3%磷酸-乙腈、0.5%冰醋酸-乙腈作為流動(dòng)相對(duì)色譜出峰情況的影響。結(jié)果表明，流動(dòng)相為0.1%磷酸-乙腈時(shí)系統(tǒng)響應(yīng)靈敏，各峰分離度良好。選擇0.1%磷酸-乙腈作為流動(dòng)相。

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)采取二極管陣列檢測(cè)器的全波長(zhǎng)掃描方式，重點(diǎn)考察了207、221、230、278、327 nm波長(zhǎng)下的譜圖。結(jié)果表明，207、221、230 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)均出現(xiàn)基線抬高的現(xiàn)象；327 nm波長(zhǎng)超過(guò)部分有效成分的最大吸收波長(zhǎng)，色譜峰數(shù)偏少；而278 nm處的色譜峰數(shù)，分離度及峰面積效果更好。故選用278 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度取適量1號(hào)供試品，按“1.3.2”方法制備供試品溶液，依“1.2.1”色譜條件進(jìn)行分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄其中一有效成分連翹苷的保留時(shí)間、峰面積，計(jì)算其RSD。結(jié)果表明，其共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.049%、峰面積RSD為2.06%，證明該方法精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性取適量1號(hào)供試品，按“1.3.2”方法制備供試品溶液6份，依“1.2.1”色譜條件進(jìn)行分析，記錄其中一有效成分連翹苷的保留時(shí)間、峰面積，計(jì)算其RSD。結(jié)果表明，其共有峰相對(duì)保留時(shí)問(wèn)RSD為0.14%、峰面積RSD為2.16%，證明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 溶液穩(wěn)定性取“2.3.1”中供試品溶液，依“1.2.1”色譜條件，于0、1、5、8、12 h分別進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，常溫下供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，其各時(shí)間點(diǎn)的保留時(shí)間與初始測(cè)得值的比值在0.98～1.02之間，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的一主成分峰面積與初始峰面積的RSD均小于3.0%。

2.4 指紋圖譜

2.4.1 指紋圖譜建立取10批蓮花清瘟顆粒樣品，按“1.3.2”方法制備供試品溶液，依“1.2.1”色譜條件進(jìn)行分析，記錄各色譜圖。使用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(版本：2012.130723),將色譜分析數(shù)據(jù)引入該系統(tǒng)內(nèi)，根據(jù)計(jì)算方法生成對(duì)照?qǐng)D譜。選用S1作為參考圖譜，多點(diǎn)校正后標(biāo)定與其他圖譜的共有峰；將各對(duì)照品的保留時(shí)間與各中醫(yī)藥材指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)分析，確認(rèn)其中共有峰。結(jié)果顯示，10批樣品中共有特征峰16個(gè)。根據(jù)對(duì)照品溶液比對(duì)結(jié)果可以鑒別出5個(gè)化學(xué)成分，分別是綠原酸、連翹苷、大黃酸、大黃素、大黃酚。指紋圖譜見(jiàn)圖1。

2.4.2 相似度評(píng)價(jià)根據(jù)10批連花清瘟顆粒的指紋圖譜的檢測(cè)結(jié)果，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)體系》(版本：2012.130723)進(jìn)行相似度計(jì)算。10批連花清瘟顆粒的相似度達(dá)到0.967之上，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 10批連花清瘟顆粒樣品的相似度計(jì)算

(續(xù)表1)

2.5 化學(xué)成分鑒定

采用HPLC法對(duì)對(duì)照品進(jìn)行分析，色譜圖見(jiàn)圖2，從連花清瘟顆粒中鑒定出綠原酸、連翹苷、大黃酸、大黃素、大黃酚這5種化學(xué)成分。通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS法對(duì)指紋圖譜色譜峰進(jìn)行確認(rèn)，利用MasterView軟件得到相對(duì)分子質(zhì)量和化學(xué)式，共鑒定出9種化學(xué)成分，分別是新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、苦杏仁苷、異綠原酸A、大黃酸、大黃素、大黃酚、連翹酯苷A，如圖3所示，數(shù)據(jù)表見(jiàn)表2。

圖2 對(duì)照品溶液的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of reference solutionRemark：Peak 1.chlorogenic acid,peak 2.forsythin,peak 3.rhein,peak 4.emodin,peak 5.chrysophanol.

表2 主要共有峰UPLC-Q-TOF-MS數(shù)據(jù)分析

圖3 10批連花清瘟顆粒樣品UPLC-Q-TOF-MS/MS正離子流圖Fig.3 UPLC-Q-TOF-MS/MS positive total ion chromatogram of ten batches of Lianhua Qingwen granule samplesPeak 1.neochlorogenic acid,peak 2.chlorogenic acid,peak 3.cryptochlorogenic acid,peak 4.amygdalin,peak 5.isochlorogenic acid A,peak 6.rhein,peak 7.emodin,Peak 8.chrysophanol,peak 9.forsythiaside A.

2.6 化學(xué)計(jì)量學(xué)考察

2.6.1 聚類分析使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行聚類分析，將10批連花清瘟顆粒樣品中的共有峰的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入該軟件，通過(guò)相關(guān)數(shù)據(jù)的組間聯(lián)接法和平方歐式距離的處理進(jìn)行分析。根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果可以判斷出，10批連花清瘟顆粒樣品被分為三部分：第一部分由S1、S2、S3、S5聚集而成；S6、S7、S8、S9、S10聚為第二部分；第三部分則為S4。結(jié)果見(jiàn)圖4，就聚類分析結(jié)果可知，不同的產(chǎn)品批次之間也會(huì)存在一些差異。

圖4 聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis graph

2.6.2 主成分分析使用多元變量統(tǒng)計(jì)軟件SIMCA14.1進(jìn)行主成分分析，將10批連花清瘟顆粒樣品的共有峰峰面積導(dǎo)入該軟件。通過(guò)相關(guān)數(shù)據(jù)的降維手段，可以將10批樣品結(jié)果分為4個(gè)主成分，數(shù)據(jù)中前兩個(gè)貢獻(xiàn)最大，累計(jì)貢獻(xiàn)率可達(dá)83.4%，充分體現(xiàn)了連花清瘟顆粒的主要信息和基本特征。以其坐標(biāo)軸為依據(jù)構(gòu)建了組成樣品的主要化學(xué)成分的二維平面，將樣品中的多元化學(xué)變量經(jīng)由降維的方式直接投影到該二維平面上，從而可以觀察到樣品的整理分布狀態(tài)情況及各種化學(xué)變量對(duì)于樣品整理分布的貢獻(xiàn)程度大小。觀察圖可知，該結(jié)果和聚類分析的結(jié)果基本一致，如圖5所示。10批連花清瘟顆粒樣品被分為3類：第一類集中分布在第四象限，分別是S1，S2，S3，S5；第二類散布在第一象限，第二象限和第三象限，分別是S6，S7，S8，S9，S10；第三類S4落在第一象限，數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。結(jié)果表明，產(chǎn)品不同批次間存在差異。

圖5 PCA散點(diǎn)得分圖Fig.5 Score plot of PCA

表3 主成分分析數(shù)據(jù)表

3 結(jié)論

本研究通過(guò)超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF-MS)建立了連花清瘟顆粒的指紋圖譜，共指認(rèn)出9個(gè)化學(xué)成分，分別是新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、苦杏仁苷、異綠原酸A、大黃酸、大黃素、大黃酚、連翹酯苷A，一定程度上對(duì)關(guān)于連花清瘟顆?，F(xiàn)有報(bào)道的指紋圖譜進(jìn)行補(bǔ)充，并對(duì)所得指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)和化學(xué)模式識(shí)別方法分析，證明該指紋圖譜可使用性，為連花清瘟質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供參考。通過(guò)方法學(xué)考察，證明該方法滿足成分復(fù)雜的中藥制劑質(zhì)量控制和新藥開(kāi)發(fā)的需求。