張 仙， 胡西洲， 張雋嫻

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，湖北武漢 430064)

氟蟲腈(Fipronil)又名芬普尼、銳勁特，它是法國羅納普朗克公司于1981開發(fā)生產(chǎn)的一種高活性且應(yīng)用廣泛的苯基吡唑類光譜殺蟲劑[1]。氟蟲腈可通過氧化還原和水解過程降解，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈硫醚。氟蟲腈代謝物在人體中的保留時間比母體更長，毒性更強[2,3]，人食用含有一定濃度的氟蟲腈食品，會損傷腎臟和肝臟，世界衛(wèi)生組織將其列為“對人類有中度毒性”的化學(xué)品[4]。氟蟲腈及其代謝物對環(huán)境及人類健康的影響受到了很多國家的關(guān)注，并對其使用及殘留量作出了明確規(guī)定，歐盟和日本規(guī)定了牛奶中氟蟲腈的限量值分別為0.005和0.02 mg/kg[5,6]。我國國家標準(GB 2763-2021)《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中明確規(guī)定了牛奶中氟蟲腈最大殘留限量為0.02 mg/kg[7]，但此標準并未規(guī)定氟蟲腈的檢測方法，國內(nèi)也尚未制定乳制品中氟蟲腈殘留量檢測的相關(guān)標準。

目前，氟蟲腈及其代謝物的檢測方法主要有氣相色譜法[8,9]、氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法[10]、液相色譜法[11]和液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法[12,13]。但這些檢測方法主要是針對氟蟲腈原藥、植物源性產(chǎn)品、環(huán)境水體中的氟蟲腈及其代謝物殘留檢測，采用氣相色譜/質(zhì)譜法檢測牛奶基質(zhì)中的氟蟲腈及其代謝物的相關(guān)報道較少。張小剛等[14]建立了一種固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定牛奶中氟蟲腈及其代謝物的分析方法；王永芳等[15]利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測定牛奶中氟蟲腈及其代謝物殘留量；羅彤等[16]利用氣相色譜-負化學(xué)源質(zhì)譜(GC-NCI-MS)測定牛奶中氟蟲腈及其3種代謝物殘留量等。本實驗將QuEChERS法與氣相色譜/質(zhì)譜法相結(jié)合，建立了一種簡便、快速、準確測定牛奶中氟蟲腈及其代謝物殘留量的分析方法。該方法通過將合適的固體吸附劑加入樣品提取液中，達到除去基質(zhì)中的干擾物和對目標組分的提取和凈化的目的，具有簡單快速、試劑用量小、檢測范圍廣、高效等優(yōu)點，可滿足快速處理大批量農(nóng)藥殘留樣品的需求。為牛奶中氟蟲腈及其代謝物殘留量的快速檢測提供技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 6890A-5975C型氣相色譜/質(zhì)譜儀(美國，Agilent公司)，配備電子轟擊源(EI)；CMVC渦旋振蕩儀(德國，Sartorius股份公司)；BSA2202S型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈砜標準物質(zhì)均購于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督測試中心，質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL。甲醇、乙腈、丙酮(色譜純，美國Baker公司)；無水MgSO4、無水NaAc(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；N-丙基乙二胺填料PSA購于上海安譜實驗科技股份有限公司。

牛奶購于便利超市。

1.2 樣品前處理

1.2.1 提取準確稱取15.00 g(精確至0.01 g)牛奶樣品于50 mL具塞塑料離心管中，加入15 mL冰HAc-乙腈溶液，渦旋振蕩3 min，水浴超聲提取20 min，加入6.0 g無水MgSO4和1.5 g無水NaAc，渦旋混勻2 min后，5 000 r/min離心3 min。

1.2.2 凈化準確稱取0.25 g PSA、0.75 g無水MgSO4置于10 mL塑料離心管中，準確吸取5.0 mL上清液至此離心管中，渦旋振蕩2 min，以5 000 r/min離心3 min。取1 mL上清液，過0.22 μm有機微孔濾膜后，供氣相色譜/質(zhì)譜測定。

1.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱，DB-5MS毛細管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；色譜柱溫度程序：90 ℃保持1 min，然后以12 ℃程序升溫至290 ℃，保持20 min；進樣口溫度320 ℃；色譜/質(zhì)譜接口溫度270 ℃；載氣，氦氣，純度≥99.999%，流速1.0 mL；進樣量1 μL；進樣方式，不分流進樣，溶劑延遲，11.0 min。

質(zhì)譜條件：EI源，70 eV；離子源溫度260 ℃。SIM模式：每個化合物選擇1個定量離子和2個定性離子，4種化合物的保留時間、母離子、子離子見表1。氟蟲腈及其代謝物標準品先用丙酮稀釋至100 μg/mL，保存于-18 ℃冰箱內(nèi)，再分別用空白牛奶基質(zhì)溶液配制成 0.010 0、0.100 0、0.150 0、0.200 0、0.500 μg/mL的混合標準工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

表1 氟蟲腈及其代謝物的保留時間、母離子和子離子

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

由于氟蟲腈及其代謝物屬于弱極性的化合物，在不同的有機溶劑中有著不同的溶解度，本實驗選用了甲醇，乙腈，1%酸化乙腈為提取溶劑，在陰性牛奶樣品中添加氟蟲腈及其代謝物的混合標準溶液，添加水平為0.01 mg/kg，按照“1.2”進行提取凈化，“1.3”進行分析，結(jié)果見圖1?？梢钥闯霎斒褂眉状甲鳛樘崛∪軇r，4種化合物的回收率僅為26.4%～47.7%；使用純乙腈提取時，4種化合物的平均提取率僅為78.4～80.6%；1%酸化乙腈提取時，回收率均可達到83.0%以上。這可能是由于氟蟲腈及其代謝物屬于弱堿性化合物，更易溶于酸性溶劑，且乙腈的極性強，有沉淀樣品中蛋白質(zhì)作用，能減少脂肪及其他雜質(zhì)的溶出從而減少了基質(zhì)對目標物的干擾。本實驗選用1%酸化乙腈作為提取溶劑。4種化合物混合標準溶液的總離子流色譜圖見圖2?？梢钥闯?，氟蟲腈及其代謝物均有較高的響應(yīng)強度，且分離效果良好。

圖1 3種提取溶劑對氟蟲腈及其代謝物回收率的影響Fig.1 Effects of three extraction solvent on the recovery of the fipronil and its metabolites

圖2 氟蟲腈及其代謝物混合標準溶液總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of fipronil and its metabolites1.Fipronil desulfinyl,2.Fipronil sulfide,3.Fipronil,4.Fipronil sulfone.

2.2 凈化條件的優(yōu)化

牛奶基質(zhì)中主要成分是水，還含有很多脂肪、磷脂、蛋白質(zhì)、乳糖等成分，這些物質(zhì)的存在會對目標化合物的檢測產(chǎn)生干擾，從而影響測定結(jié)果的準確性，經(jīng)過乙腈提取后需通過凈化去除這些雜質(zhì)的干擾，才能使得目標物分離的更好，同時也能減少雜質(zhì)對儀器的污染。結(jié)合牛奶基質(zhì)特性以及氟蟲腈類化合物的理化性質(zhì)，本實驗比較了Florisil固相萃取柱、氨基-石墨化炭黑復(fù)合柱和經(jīng)典的QuECHERS法對樣品的凈化，對加標0.1 mg/kg混合標準溶液的牛奶提取液進行凈化比較回收率，從回收率高低、凈化所需時間、耗材的成本進行綜合評價，結(jié)果顯示Florisil固相萃取柱回收率偏低，QuEChERS法和氨基-石墨化炭黑復(fù)合柱的回收率相當，但氨基-石墨化炭黑復(fù)合柱操作過程復(fù)雜，耗費時間較長且活化洗脫柱子耗費有機試劑較多對環(huán)境污染較大，而QuEChERS法操作過程簡單快速且回收率能到到要求，綜合以上考慮，選用QuECHERS法對提取液進行凈化。三種凈化方法的回收率結(jié)果如圖3所示。

圖3 牛奶中氟蟲腈及其代謝物不同凈化方式的回收率Fig.3 Recoveries of fipronil and its metabolites in milk by different purification methods

2.3 方法評價

2.3.1 線性范圍和方法檢出限依次測定0.01、0.10、0.15、0.20、0.50 μg/mL的混合標準工作液，以氟蟲腈及其代謝物的峰面積(y)對其質(zhì)量濃度(x)繪制其線性工作曲線，這4種農(nóng)藥在0.01～0.50 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2>0.997。0.01 μg/mL標準溶液連續(xù)進樣6次，以3倍和10倍信噪比(S/N)確定各化合物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果見表2。氟蟲腈及其代謝物的檢出限為0.30～0.68 μg/kg，定量限為0.90～1.20 μg/kg。

表2 4種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限(LOD)及定量限(LOQ)

2.3.2 方法回收率和精密度取15.00 g 陰性牛奶樣品，添加0.010、0.100、0.500 mg/kg 3個水平的氟蟲腈及其代謝物，每個水平做6個平行樣，按照“1.2”進行樣品前處理，按“1.3”進行測定，結(jié)果見表3。4種化合物平均回收率在83.7%～112.6%，精密度RSD在1.8%～4.2%，均滿足國標(GB/T 27404-2008)《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》對方法技術(shù)參數(shù)的要求。

表3 加標牛奶中4種化合物的平均回收率和RSD(n=6)

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察樣品在分析過程中，受基質(zhì)效應(yīng)的影響，目標化合物會發(fā)生離子增強或減弱效應(yīng)，從而影響測定結(jié)果的準確性。本實驗以基質(zhì)匹配校準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率考察不同化合物的基質(zhì)效應(yīng)，比值越接近1，則基質(zhì)效應(yīng)越小[17]。比較純?nèi)軇┍团Ｄ袒|(zhì)空白配制的標準溶液的基質(zhì)效應(yīng)，氟蟲腈及其代謝物的基質(zhì)效應(yīng)在98.7%～106.3%之間。說明了本實驗的凈化方法具有較好的凈化效果。為了更準確的測定目標化合物降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，本實驗采用基質(zhì)匹配標準曲線進行定量測定。

2.4 方法比較

將本實驗所建立的QuEChERS-氣相色譜/質(zhì)譜法與目前已有的關(guān)于乳制品中氟蟲腈及其代謝物殘留量的檢測方法[14 - 16]進行比較，包括提取溶劑、凈化方法、檢出限、平均回收率等。結(jié)果如表5所示，相比其他方法，本方法的檢出限與文獻報道的LC-MS/MS檢測方法相當，且操作簡單快速，樣品前處理過程中所需試劑和耗材較少，成本低污染小，具有良好的操作性和實用性。

表5 與已有其他方法的比較

2.5 實際樣品的測定

采用本實驗建立的檢測方法對市場上 30個牛奶樣品進行測定，所有樣品均未檢出氟蟲腈及其他三種代謝物。

3 小結(jié)與討論

本實驗利用QuEChERS前處理方法，結(jié)合GC/MS，建立了針對牛奶中氟蟲腈及其他三種代謝物殘留的檢測方法，并對提取條件、凈化條件進行了優(yōu)化，對基質(zhì)效應(yīng)及方法學(xué)進行了考察。經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法的回收率、精密度、線性、定量限、檢出限等均滿足農(nóng)藥多殘留檢測技術(shù)的要求。該方法提取效率高、凈化速度快、前處理簡單快速、易于操作，可大大節(jié)省檢測時間，適合大批量樣品的快速篩查；檢測成本低，不需要固相柱凈化，節(jié)省了耗材及試劑；整個過程對環(huán)境污染也較小。目前國內(nèi)還沒有乳制品中氟蟲腈及其代謝物殘留量檢測的相關(guān)標準，該方法的建立可以為后期我國建立相關(guān)標準提供檢測方法和數(shù)據(jù)參考，也可以為安全監(jiān)管部門提供技術(shù)支持。