田 銳*， 高 闖， 黨珍珍， 孫雪花， 馬紅燕

(延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，延安市分析技術(shù)與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西延安 716000)

SiO2納米粒子由于其良好的光學(xué)特性、穩(wěn)定性、生物相容性及易于功能化等特征在分析領(lǐng)域備受關(guān)注[1,2]?；跓晒釹iO2納米粒子的熒光分析法在分析檢測(cè)、生物成像等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[3 - 6]。苦味酸(2,4,6-三硝基苯酚)是一種有毒的硝基酚類化合物，該化合物在染料、炸藥、煙花、玻璃、醫(yī)藥殺菌劑、皮革工業(yè)以及農(nóng)業(yè)等方面有著廣泛應(yīng)用[7 - 9]。但排放于環(huán)境中的苦味酸會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，對(duì)人的皮膚、眼睛、呼吸道等產(chǎn)生毒害作用，還會(huì)損傷肝臟和腎臟、引起慢性中毒等[10,11]。因此，對(duì)環(huán)境中苦味酸的檢測(cè)具有十分重要的意義。目前已經(jīng)報(bào)道的檢測(cè)苦味酸的方法主要有：高效液相色譜法[12]、液-質(zhì)聯(lián)用法[13]、氣-質(zhì)聯(lián)用法[14]、拉曼光譜法[15]、電化學(xué)法[16]、熒光分析法[17]等。熒光檢測(cè)法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、分析速度快、實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，在分析檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用，研究檢測(cè)苦味酸的熒光探針也具有重要意義。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苦味酸對(duì)組裝于殼聚糖(CS)/SiO2納米粒子上的羅丹明B(RhB)的熒光有較強(qiáng)的猝滅作用。據(jù)此，實(shí)驗(yàn)制備了RhB/CS/SiO2納米粒子，利用苦味酸對(duì)RhB/CS/SiO2納米粒子的熒光猝滅作用，建立了一種靈敏、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)苦味酸的熒光分析新方法，并將其用于水樣中苦味酸的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

熒光分光光度計(jì)(F-2700，日本日立科學(xué)儀器有限公司)；瞬態(tài)穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀(FLSP920，英國愛丁堡公司)；紫外-可見吸收光譜儀(8453，美國安捷倫公司)；離心機(jī)(H1850，湘儀離心機(jī)有限公司)；多點(diǎn)磁力攪拌器(RO10，德國IKA公司)；電子天平(BSA224S-CW，德國賽多利斯公司)。

苦味酸(PA)(分析純，西亞試劑有限公司)；羅丹明B(RhB)(分析純，西安化學(xué)試劑廠)；Triton X-100、正硅酸乙酯、殼聚糖(CS)(分析純，Sigma公司)。其他所用的常見試劑如正己醇、環(huán)已烷、丙酮等均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 納米粒子的制備

參考文獻(xiàn)方法[18]，采用反相微乳液法，以殼聚糖(Chitosan，CS)為模板，正硅酸乙酯為硅源制備納米粒子。具體步驟為：合成瓶中加入1.8 mL Triton X-100、1.8 mL正己醇和7.5 mL環(huán)己烷，混合均勻后，加入150 μL的超純水?dāng)嚢?0 min，然后加入100 μL CS溶液攪拌1 h，之后緩慢加入NaOH溶液調(diào)節(jié)體系pH值至中性，最后加入80 μL的正硅酸乙酯和60 μL氨水，室溫?cái)嚢杷?4 h。反應(yīng)完成后破乳、離心、洗滌，得產(chǎn)物CS/SiO2納米粒子。

將等體積的1.0×10-3mol/L RhB溶液與上述制備的CS/SiO2納米粒子分散液混合后，振蕩組裝30 min 后離心、洗滌得RhB/CS/SiO2納米粒子。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

取0.20 mL RhB/CS/SiO2納米粒子分散液于比色管中，加入0.30 mL B-R緩沖溶液(pH=11.0)，再加入一定量的苦味酸溶液，最后用超純水稀釋至總體積為2.00 mL。反應(yīng)50 min后，在熒光分光光度計(jì)上測(cè)定樣品組(F)和對(duì)照組(F0)的熒光信號(hào)值，根據(jù)ΔF(ΔF=F0-F)與苦味酸濃度的關(guān)系定量測(cè)定苦味酸含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米粒子的表征

對(duì)制備的納米粒子進(jìn)行了透射電子顯微鏡和傅里葉變換紅外光譜表征(圖1)。從圖1A中可以看出，CS/SiO2納米粒子為具有疏松多孔結(jié)構(gòu)、粒徑60 nm左右的球型；圖1B紅外光譜圖顯示，CS/SiO2納米粒子同時(shí)具有SiO2和CS的特征吸收峰，表明CS被復(fù)合進(jìn)了納米粒子中。

圖1 Chitosan/SiO2納米粒子的透射電鏡(TEM)圖(A)和傅里葉變換紅外(FTIR)光譜圖(B)Fig.1 TEM image(A) and FTIR spectra(B) of Chitosan/SiO2 nanoparticles

2.2 光譜及傳感性質(zhì)

分別測(cè)定RhB、RhB/CS/SiO2及RhB/CS/SiO2-PA的熒光發(fā)射光譜(圖2)，圖中各曲線發(fā)射峰位置一致，說明CS/SiO2及苦味酸都不會(huì)影響RhB的發(fā)射性質(zhì)，但是通過比較加入苦味酸前后(曲線b、c)發(fā)射峰的強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)苦味酸加入后體系的熒光信號(hào)明顯降低，這是由于苦味酸對(duì)RhB的熒光產(chǎn)生了猝滅作用。

圖2 熒光光譜圖(a.羅丹明B；b.RhB/Chitosan/SiO2；c.RhB/Chitosan/SiO2-PA)Fig.2 Fluorescence spectra(a.RhB;b.RhB/Chitosan/SiO2;c.RhB/Chitosan/SiO2-PA)

為了考察RhB/CS/SiO2納米粒子的傳感性能，實(shí)驗(yàn)比較了苦味酸對(duì)RhB、RhB/SiO2和RhB/CS/SiO2納米粒子的熒光猝滅情況，結(jié)果表明相同條件下苦味酸對(duì)RhB/CS/SiO2熒光納米粒子的熒光猝滅程度最大(圖3)。這可能是由于CS的制孔作用使CS/SiO2納米粒子具有孔結(jié)構(gòu)[19]，增大了CS/SiO2納米粒子的比表面積和RhB組裝量，同時(shí)也得使苦味酸更容易擴(kuò)散進(jìn)入納米粒子內(nèi)與RhB分子作用使其熒光猝滅，而由于納米粒子微環(huán)境中RhB分子彼此間距離較小，形成信號(hào)放大效應(yīng)[20]。實(shí)驗(yàn)同時(shí)還對(duì)CS用量、RhB用量及組裝時(shí)間進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，在合成時(shí)加入100 μL 0.1%的CS所制備的CS/SiO2納米粒子對(duì)RhB的組裝和苦味酸的傳感性能最好，具體為CS/SiO2納米粒子分散液與等體積1.0×10-3mol/L RhB振蕩組裝30 min時(shí)，所得RhB/CS/SiO2納米粒子的傳感靈敏度最高。

圖3 羅丹明B、RhB/SiO2和RhB/Chitosan/SiO2的傳感性能比較Fig.3 Fluorescence sensing performance of RhB,RhB/SiO2 and RhB/Chitosan/SiO2

2.3 熒光壽命與吸收光譜

為了探討苦味酸對(duì)RhB/CS/SiO2納米粒子的熒光猝滅作用，實(shí)驗(yàn)測(cè)定了加入苦味酸前后RhB/CS/SiO2熒光納米粒子的熒光壽命。實(shí)驗(yàn)表明RhB/CS/SiO2熒光納米粒子的熒光壽命沒有發(fā)生變化(圖4)，說明苦味酸對(duì)RhB/CS/SiO2熒光納米粒子的猝滅為靜態(tài)猝滅[21]，這與紫外-可見吸收光譜(圖5)結(jié)果一致。

圖4 RhB/Chitosan/SiO2溶液加入PA前后的熒光壽命曲線Fig.4 Time -resolved fluorescence decay curve of RhB/Chitosan/SiO2 in the presence and absence of PA

圖5 苦味酸、RhB/Chitoasan/SiO2和RhB/Chitosan/SiO2-PA的UV-Vis吸收光譜Fig.5 UV-Vis absorption spectra of PA、RhB/Chitoasan/SiO2 and RhB/Chitosan/SiO2-PA

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.4.1 pH的影響在pH為2.0～12.0范圍內(nèi)(B-R緩沖溶液)，考察了pH對(duì)測(cè)定的影響。結(jié)果表明，當(dāng)體系pH為11.0時(shí)ΔF最大(圖6)。這可能是由于在堿性條件下苦味酸會(huì)被去質(zhì)子化，從而促進(jìn)了它與RhB的結(jié)合，但是如果堿性太強(qiáng)，RhB也會(huì)產(chǎn)生去質(zhì)子化，導(dǎo)致其從納米粒子上脫落，故實(shí)驗(yàn)確定pH為11.0。

圖6 pH對(duì)體系的影響Fig.6 Effect of pH on the system

2.4.2 緩沖液用量及反應(yīng)時(shí)間的影響實(shí)驗(yàn)考察了B-R緩沖溶液用量對(duì)測(cè)定靈敏度的影響。結(jié)果表明，緩沖液用量為0.30 mL時(shí)ΔF值最大，故實(shí)驗(yàn)確定緩沖液用量為0.30 mL。

室溫下，苦味酸和RhB/CS/SiO2熒光納米粒子作用時(shí)間的長短直接影響檢測(cè)靈敏度。因此，考察了作用時(shí)間對(duì)RhB/CS/SiO2熒光猝滅的影響。結(jié)果表明，RhB/CS/SiO2熒光納米粒子與苦味酸作用50 min后ΔF基本不變，因此實(shí)驗(yàn)選擇時(shí)間為50 min。

圖7 有機(jī)化合物對(duì)體系熒光猝滅程度的影響Fig.7 Effect of organic compounds on fluorescence quenching efficiency of the system

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)苦味酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，在5.0×10-6～6.0×10-4mol/L濃度范圍內(nèi)，體系的ΔF與苦味酸濃度呈良好線性，線性方程為：ΔF=3.41×106c+465.84，相關(guān)系數(shù)r=0.9990，檢出限為3.0×10-6mol/L。方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.21%(cPA=1.0×10-5mol·L-1，n=11)。

2.6 樣品分析

向未檢出苦味酸的水樣中，加入一定量的苦味酸溶液測(cè)定回收率，檢測(cè)到的苦味酸濃度與加入濃度基本一致，表明方法可以用于水樣中苦味酸的檢測(cè)。

表1 樣品中苦味酸測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本文采用反相微乳液法，以殼聚糖(CS)為模板合成了CS/SiO2納米粒子，通過振蕩吸附將羅丹明B(RhB)組裝在其上得RhB/CS/SiO2納米粒子。利用苦味酸對(duì)RhB/CS/SiO2納米粒子的熒光猝滅作用，建立了測(cè)定苦味酸的熒光分析新方法。該方法具有很好的靈敏度和選擇性，可用于環(huán)境水體中苦味酸的分析檢測(cè)。